单增李斯特菌hly基因缺失株的构建及重要特性分析

赵莹莹，贾艳艳，杜付玉，余祖华，廖成水，何 雷，李银聚，张春杰

(1.河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室，河南洛阳471000；2.洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室，河南洛阳471000)

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种革兰氏阳性的人畜共患致病菌，能够穿透人体及动物的肠道、血脑和胎盘屏障，感染后可以引发早产或流产，脑膜炎，败血症和脑炎等症状，死亡率高达30 %～70 %[1]。由LM 引起的食物中毒的情况日趋严重，已引起各国相关组织的高度重视。

LM 进入机体后，可以感染肝细胞、巨噬细胞和DC 等多种细胞。这些细胞表面受体能够识别LM 表面的一系列Toll 样受体配体，并激发炎症级联反应，释放前炎性细胞因子，从而发挥天然免疫应答作用[2]。LM 感染产生强烈的天然免疫应答，能够直接或间接促进获得性免疫应答的产生[3]。LM 被巨噬细胞吞噬后，大部分细菌被降解，其抗原表位递呈给MHCⅡ类分子，诱导CD4+T 细胞免疫应答。部分细菌通过1isteriolysin O (LLO)的溶膜作用逃离吞噬体进入胞浆，其抗原表位递呈给MHCⅠ类分子，诱导CD8+T 细胞免疫应答，这种独特免疫应答机制使减毒LM 成为一种具有吸引力的疫苗载体[4-5]。

由hly基因编码的LLO 是一个最重要的毒力因子[6-8]。溶血素是一种分泌性蛋白，由505 个氨基酸组成，相对分子质量为56 000 ku。该蛋白具有形成孔道的特性，能够裂解细胞内的吞噬体膜，使LM逃离吞噬体进入胞液，促进细菌在细胞胞内的增殖[9]。

为开发安全有效的LM 疫苗，本研究通过对hly基因序列分析和查阅文献[10]，发现hly基因序列的112 bp～153 bp 属于重要毒力区，因此对hly基因的这一段编码序列进行敲除，构建LM△hly112-153缺失菌株，从溶血能力、对巨噬细胞的侵袭能力等方面研究LM△hly112-153的生物学特性，并评价其对小鼠的免疫保护力，从而为开发LM 减毒疫苗奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 李斯特菌野生菌株LM10403S、小鼠单核巨噬细胞J774A.1、pKSV7 穿梭载体和大肠杆菌DH5α 均由河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室保存；pMD19-T 克隆载体、TaqDNA聚合酶、T4 DNA 连接酶和各种限制性内切酶、X-Gal 及IPTG 均购自TaKaRa 公司；细菌基因组抽提试剂盒、质粒小量提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；脑心浸液(BHI)培养基购自青岛海博生物技术有限公司；6周龄～8 周龄BALB/c 雌性小鼠购自郑州大学实验动物中心。

1.2 引物的设计与合成 参照GenBank 中登录的hly基因序列(ID：987033)设计引物(表1)，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表1 本实验所需的引物Table 1 The sequence of primer pairs used to amplify related genes

1.3 重组质粒pKSV7-hlya-hlyb的构建与鉴定 参照细菌基因组抽提试剂盒说明抽提野生菌株LM 基因组DNA，分别用引物hlya1/hlya2 和hlyb1/hlyb2 扩增hly基因的上下游同源臂。以回收的hlya 和hlyb片段为模板，通过引物hlya1 和hlyb2，采用重叠延伸PCR (SOEing PCR)的方法将hlya、hlyb 拼接成hlya-hlyb，按照DNA 凝胶回收试剂盒程序回收hlya-hlyb 片段。

将回收得到的hlya-hlyb 片段克隆于pMD19-T中，构建重组质粒pMD19-T-hlya-hlyb，经双酶切和测序鉴定。

用KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pMD19-T-hlya-hlyb，将回收到的酶切产物hlya-hlyb 克隆于pKSV7 载体，然后转化至大肠杆菌感受态DH5α。挑取单菌落扩大培养后抽提重组质粒酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pKSV7-hlya-hlyb。

1.4 LM△hly112-153缺失株的构建 采用电转化方法将重组质粒pKSV7-hlya-hlyb导入LM 感受态细胞中，通过在42 ℃和氯霉素双重抗性压力下实现同源重组，由于pKSV7 是温度敏感型穿梭质粒，将其在无抗性压力下传代，以消除载体，最终实现hly毒力区42 bp 片段的缺失，获得在氯霉素抗性下不能生长的菌株，然后以此菌株为模板，用引物hlya1/hlyb2 进行PCR 扩增鉴定，鉴定正确的菌株由北京华大基因有限公司进行测序，并命名为LM△hly112-153。

1.5 LM△hly112-153溶血活性的测定 将LM、LM△hly112-153接种BHI 培养基，37 ℃培养12 h 后离心取上清，用PBS 调整二者至OD600nm相同，用PBS将LM、LM△hly112-153菌液2 倍倍比稀释至210，同时以PBS 作为阴性对照，分别加70 μL 至96 孔V 型板中，然后每孔加入30 μL 1 %绵羊红细胞，微振荡混匀，37 ℃培养1 h 后观察二者的溶血情况。

1.6 LM△hly112-153对巨噬细胞J774.1 侵袭率的测定 将J774.1 细胞以2.0×105cells/孔接种于24 孔板，培养至单层细胞后，改用不含双抗、含10 %FCS 的DMEM 继续培养2 h；将LM 及LM△hly112-153按MOI为100∶1 分别感染J774.1 细胞，作用2 h；PBS 洗3 次后加入含庆大霉素(100 μg/mL)的DMEM培养基作用1.5 h；PBS 洗3 次，用0.1 % Triton-100裂解细胞，裂解液稀释后取100 μL 涂布于BHI 培养板，37 ℃培养24 h 后计数统计分析LM△hly112-153对巨噬细胞J774.1 的侵袭率。

1.7 LM△hly112-153对小鼠半数致死量(LD50)的测定取对数生长期的LM△hly112-153与LM 悬浮菌液6 000 r/min 离心3 min，PBS 洗涤重悬后测定其OD600nm，根据预试验选取合适的稀释度，具体稀释度见表2。每个稀释度腹腔注射5 只6 周龄BALB/c 小鼠，每只小鼠注射剂量为100 μL，并设无菌PBS 为空白对照组。观察2 周，记录小鼠死亡情况，采用Bliss 方法计算基因缺失株和野生株对BALB/c 小鼠的LD50[11]。

1.8 LM△hly112-153对小鼠免疫保护率的测定 将24只6 周龄BALB/c 小鼠随机分为实验组和对照组，实验组用0.1 LD50LM△hly112-153免疫，分别于第1 d和第8 d 以LM△hly112-153100 μL/只(4.0×107cfu)腹腔注射免疫小鼠，对照组每只小鼠腹腔注射100 μL PBS。在二免后第8 d 分别对实验组和对照组小鼠100 μL/只(1.0×106cfu)腹腔注射野生菌株。攻毒后持续观察记录免疫小鼠生长及死亡情况，评价LM△hly112-153的免疫保护效果。

2 结 果

2.1 重组质粒pKSV7-hlya-hlyb的构建与鉴定 将鉴定正确的重组质粒pMD19-T-hlya-hlyb与pKSV7经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切回收后，连接、转化至DH5α，抽提重组质粒，经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切鉴定，产物出现约7 000 bp 和1 300 bp 两条目的带，与预期相符(图1)，表明构建了重组质粒pKSV7-hlya-hlyb。

图1 重组质粒pKSV7-hlya-hlyb 的酶切鉴定Fig.1 Restriction enzyme digestion of recombinant plasmid pKSV7-hlya-hlyb

2.2 LM△hly112-153缺失株的筛选与鉴定 将重组质粒pKSV7-hlya-hlyb 电转化至LM 感受态细胞中，通过在42 ℃和氯霉素抗性压力的双重筛选实现同源重组，利用引物hlya1/hlyb2 对疑似重组菌株进行PCR 扩增，扩增产物测序后结果显示hly基因序列少了42 bp 的目标毒力区，与预期结果相符，表明正确构建出LMhly基因缺失株LM△hly112-153。

2.3 LM△hly112-153溶血活性测定结果 将PBS 以及倍比稀释后的LM、LM△hly112-153菌液于96 孔V 型板中与30 μL 1 %绵羊红细胞互作，结果显示，LM△hly112-153的溶血效价为26，野生株LM 的溶血效价为24(图2)，表明hly112-153基因的缺失导致LM 溶血效价的降低，但并未导致其编码的毒力因子LLO 的溶血活性完全失活。

图2 LM△hly112-153 的溶血性试验Fig.2 Hemolytic test of LM△hly112-153

2.4 LM△hly112-153对巨噬细胞J774.1 的侵袭率的测定 将LM 及LM△hly112-153分别感染J774.1 细胞，检测LM 和LM△hly112-153对巨噬细胞J774.1 的侵袭能力。结果显示，LM 和LM△hly112-153对J774.1 的侵袭率分别为13.9 %和0.46 %，LM△hly112-153对J774.1细胞的侵袭能力极显著低于野生株(p<0.01)(图3)，表明hly基因在LM 侵袭细胞过程中发挥着重要作用。

图3 野生菌株和缺失菌株对J774.1 细胞侵袭能力的比较Fig.3 Comparison of invasive abilities between wild and deleted strains to J774.1 cells

2.5 LM△hly112-153对小鼠LD50的测定结果 对实验小鼠腹腔注射不同稀释度的LM △hly112-153，通过Bliss 法计算其LD50为4.253×108cfu，高于野生株LM 3 个数量级(表2)，表明hly部分基因敲除后，LM△hly112-153的毒力显著下降。

表2 LM 菌株对BALB/c 小鼠的LD50 测定Table 2 LD50 of LM strains for BALB/c mice

2.6 LM△hly112-153对小鼠免疫保护率的测定 LM△hly112-153二免8 d 后采用1.0×106cfu/只对LM 小鼠攻毒，结果显示对照组小鼠于攻毒后7 d 内全部死亡，实验组7 d 内死亡3 只小鼠，8 d～15 d 死亡1只，其余11 只小鼠存活至观察期结束，并且存活小鼠精神状态良好，免疫保护率为75 % (表3)。表明该基因缺失株安全性好，并且能够对小鼠产生较好的免疫保护效果。

表3 LM△hly112-153 对BALB/c 小鼠免疫保护率的测定Table 3 Determination of immunoprotection rate of BALB/c mice by LM△hly112-153

3 讨 论

减毒LM 是兼性胞内菌，能够运送抗原进入MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类抗原加工、提呈途径，诱导强烈的CD8+T 细胞免疫应答和CD4+T 细胞免疫应答，并且能够刺激细胞产生较多的IFN-γ、IL-18、IL-12 等细胞因子，目前已被证实是一种理想的外源抗原表达载体[12-13]。作为疫苗载体，安全性至关重要。研究发现，LM 基因组有多个毒力因子，其中由hly编码的LLO 是一种穿孔毒素，能够溶解宿主细胞内吞小体膜，使细菌逃离吞噬体，进入胞浆，从而避免被吞噬细胞杀伤，这是细菌得以在胞质内增殖的先决条件。LM10403S 是遗传背景较清晰的李斯特菌标准强毒菌株，因此本研究以标准株LM10403S 为研究对象，利用同源重组技术构建出hly基因缺失菌株LM△hly112-153，对其生物学特性进行分析，并评价了该基因缺失株的免疫保护效果。

考虑到细菌安全性与侵袭性的平衡，在构建缺失菌株时，本研究通过对hly基因序列分析，最终确定hly基因112 bp～153 bp 基因序列为目标删除序列，通过同源重组技术对该毒力区进行了缺失。试验分析了LM△hly112-153对巨噬细胞的侵袭能力，结果显示与野生菌株LM 相比，LM△hly112-153的胞内侵袭率下降约96 %，表明hly基因部分缺失降低了细菌对巨噬细胞侵袭性。为进一步确认该基因缺失株的毒力，本研究进行了小鼠攻毒试验，结果显示基因缺失株的毒力比野生菌株降低了3 个数量级，表明hly基因缺失引起细菌的毒力显著降低。

LLO 是LM 逃脱吞噬体的重要蛋白，在细胞溶血性试验中发现LLO 部分毒力区的缺失导致细菌溶血活性降低了2 个滴度，但并未使LM△hly112-153中LLO 活性完全丧失，这些结果表明LM△hly112-153仍可能通过LLO 的溶膜作用逃离吞噬体而进入胞浆中，并将其抗原表位递呈给MHCⅠ类分子，诱导CD8+T 细胞免疫应答。同时免疫保护实验结果显示，LM△hly112-153免疫后的小鼠能够抵抗野生菌株LM 的攻击，免疫保护率达75 %，这为LM△hly112-153作为防控李斯特菌病的候选疫苗奠定良好的研究基础。

本研究通过重组自杀性质粒构建了减毒李斯特hly基因缺失菌株LM△hly112-153，并分析了其生物学特性和免疫保护力。研究结果显示基因缺失株毒力比野生菌株显著降低，安全性好，且对小鼠产生较好的免疫保护效果。本研究对李斯特菌病的防控研究和减毒LM 疫苗的研发具有重要意义。