猪IL-21的真核表达及其与CD40L共刺激抗体分泌的活性研究

杨贝贝，符 芳，薛 美，冯 力，刘平黄

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069)

IL-21 属于多效性I 型细胞因子，主要由CD4+T细胞和自然杀伤T (NKT)细胞产生，在固有免疫和适应性免疫应答中均发挥着重要作用[1]。IL-21 与其受体结合后可以介导多种生物学效应：(1)在B 细胞中，IL-21 可以强力促进初始B 细胞、浆细胞、记忆性B 细胞的增殖和分化[2-4]，进而促进抗体的产生、抗体类别转换；(2)在滤泡辅助性T (Tfh)细胞中，IL-21 可以上调转录因子BCL-6 和MAF 的表达，二者是控制Tfh 细胞转录的关键，因此IL-21可以调节Tfh 细胞的发育[5]；(3)在CD4+T 细胞中，IL-21 可以促进CD4+T 细胞分泌IL-22[6]，分泌的IL-22 在粘膜修复和防御感染中起着重要作用[7-8]；(4)在CD8+T 细胞中，IL-21 可以作为辅助CD8+T细胞活化的第三信号，增强CD8+T 细胞的细胞毒活性。

猪IL-21 最早发现于2003 年，其基因定位于猪第8 号染色体(8q22→q23)，猪IL-21 cDNA 由456个碱基对组成，编码152 个氨基酸[9]。猪IL-21 的氨基酸序列与牛、人和鼠IL-21 分别具有86.2%、77 %和58.4 %的同源性[9]。目前对于人和鼠IL-21 已经有许多的研究，而猪IL-21 在免疫应答中的作用相关研究并不多。本研究通过将猪IL-21 序列3' 端加上Fc 标签，构建含有猪IgG Fc 标签序列的真核表达质粒pcDNA3.1(-)/IL-21-Fc，表达并纯化了具有生物学活性的猪IL-21 融合蛋白，并对其生物学功能进行了初步研究，为进一步探究猪IL-21 在适应性免疫应答中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与载体 293T 细胞和pcDNA3.1 载体为本实验室保存；含有猪IL-21-Fc 基因(内含猪IL-21 信号肽序列)的pUC57-pigIL-21-Fc 质粒(添加NheⅠ与XhoⅠ限制性酶切位点)由南京金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 主要试剂 DL2000 DNA Marker、 Primer STAR DNA 聚合酶和PrimeScript II1st strand cDNA Synthese Kit 购自TaKaRa 公司；T4 DNA 连接酶与限制性内切酶购自NEB 公司；标准蛋白Marker、Alexa Fluor 546 标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体购自Thermo Fisher 公司；Attractene 转染试剂购自QIAGEN 公司；Alexa Fluor 488 标记的羊抗猪IgG(H+L)抗体购自SouthernBiotech 公司；IRDye700DX驴抗鼠IgG 购自LI-COR 公司；鼠抗猪IL-21 单克隆抗体(MAb)、建立ELISA 标准曲线所用的猪IgG 标准品为本实验室制备；Biotin 化的鼠抗猪IL-21 MAb 通过将上述IL-21 MAb 标记所得；鼠抗猪IgG 购自Bio-Rad 公司；兔抗猪HRP-IgG 多抗购自Abcam 公司；protein A 亲和层析树脂和人CD40L 蛋白购自南京金斯瑞公司；Glycine 与TMB 购自Amresco 公司；HRP-Streptavidin、Tris、DAPI、淋巴细胞活化剂lipopolysaccharide (LPS)购自Sigma 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 pcDNA3.1(-)/IL-21-Fc 真核表达载体的构建与鉴定 将pUC57-pig IL-21-Fc 质粒经NheⅠ与XhoⅠ双酶切后将目的片段亚克隆于pcDNA3.1(-)载体，构建真核表达质粒pcDNA-IL-21-Fc。重组质粒经NheⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定后，由吉林库美生物科技有限公司测序鉴定。

1.4 猪IL-21 融合蛋白(rpIL-21-Fc)的表达与检测将pcDNA3.1/IL-21-Fc 瞬时转染HEK 293T 细胞，设置pcDNA3.1(-)空载体转染对照组。在转染36 h 后收集细胞，经4 %多聚甲醛4 ℃固定后，从以下两个角度验证rpIL-21-Fc 的表达：以Alexa Fluor 488标记的羊抗猪IgG (1:100)为直标抗体检测猪Fc 标签的表达；另以鼠抗猪IL-21 MAb (5 μg/mL)为一抗、Alexa Fluor 546 标记的羊抗鼠IgG (1∶200)为二抗检测猪IL-21 的表达。DAPI 染核10 min 后，于倒置荧光显微镜下观察荧光，通过间接免疫荧光(IFA)验证融合蛋白的表达。

1.5 rpIL-21-Fc 纯化效果检测

1.5.1 纯化的rpIL-21-Fc 的western blot 检测利用protein A 通过亲和层析法分离纯化1.4 转染上清中的猪IL-21 融合蛋白，SDS-PAGE 检测纯化效果。以鼠抗猪IL-21 MAb (1∶1 000)为一抗，驴抗鼠IgG (1∶10 000)为二抗，western blot 检测纯化的rpIL-21-Fc。

1.5.2 纯化的rpIL-21-Fc 的ELISA 检测以5 μg/mL纯化的rpIL-21-Fc 作为包被抗原，Biotin 标记的鼠抗猪IL-21 MAb (1 ∶1 000)为一抗，HRP-Streptavidin(1∶600)为二抗，同时没未包被融合蛋白的孔为空白对照，经ELISA 检测纯化的rpIL-21-Fc。

1.6 rpIL-21-Fc 的生物学活性测定 取新鲜猪外周血，利用密度梯度离心法分离PBMCs[10]。计数后用PBMC 培养液重悬细胞，调整细胞密度至1×106个细胞/mL，同时加入终浓度为10 ng/mL 的LPS 预刺激PBMCs，200 μL/孔铺于96 孔板。24 h 后，弃掉原有培养液，向各孔分别加入含不同浓度的猪IL-21 融合蛋白(25 ng/mL、50 ng/mL)与人CD40L(人CD40L 与猪CD40L 高度同源，可以用于刺激猪PBMCs)(1 μg/mL)的培养液，同时设置正常细胞对照(不加IL-21+CD40L 刺激)与仅用CD40L 刺激的对照组。参照文献[11]，通过ELISA 定量检测刺激后不同时间点(1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、7 d)各组PBMCs 培养上清中IgG 的分泌情况。具体ELISA 步骤如下：以鼠抗猪IgG (1∶250)包被ELISA 板，以上述不同培养条件下收取的PBMC 上清作为一抗，以HRP-兔抗猪IgG (1∶80 000)为二抗。同时以系列稀释的纯化的猪IgG 作为标准品，根据各标准品浓度对应的OD450nm值绘制标准IgG 曲线，将各样品孔(即PBMC 上清)的OD450nm代入标准曲线公式，得到样品孔IgG 的浓度，再乘以样品体积即为各96 孔分泌猪IgG 的含量。

2 结 果

2.1 pcDN A-IL-21-Fc 重组质粒的构建与鉴定pUC57-IL-21-Fc 质粒经NheⅠ/XhoⅠ双酶切切下IL-21-Fc 片段，克隆至pcDNA3.1(-)载体中，构建真核表达质粒pcDNA-IL-21-Fc。经NheⅠ和XhoⅠ双酶切初步鉴定，结果显示，在约1200 bp 处出现目的条带，与预期符合(图1)。挑选阳性重组质粒测序，经与GenBank 中登录的猪IL-21 基因序列(NM_214415)比对，结果显示二者序列完全一致，表明构建了重组质粒pcDNA-IL-21-Fc。

图1 重组质粒pcDNA3.1/IL-21-Fc 的双酶切鉴定Fig.1 Identification of pcDNA3.1/IL-21-Fc by double enzyme digestion

2.2 rpIL-21-Fc 表达的检测 重组质粒pcDNA-IL-21-Fc 转染293T 细胞36 h 后，采用IFA 分别通过检测Fc 标签蛋白和IL-21 的表达来验证rpIL-21-Fc的表达。结果显示，与转染pcDNA3.1 空载体的对照细胞相比，转染pcDNA-IL-21-Fc、以AF488 标记的羊抗猪IgG 为抗体(检测融合蛋白中的Fc 标签蛋白)的细胞有特异性绿色荧光(图2A)；以鼠抗猪IL-21 MAb 为一抗、AF 546 标记的羊抗鼠IgG 为二抗(检测融合蛋白的IL-21)的细胞有红色荧光(图2B)。表明重组质粒pcDNA-IL-21-Fc 转染293T 细胞后瞬时表达了rpIL-21-Fc。

图2 rpIL-21-Fc 中Fc 标签表达(A)和猪IL-21 蛋白的表达(B)的IFA 检测Fig.2 Detection of the expression of Fc tag protein (A)or pig IL-21 protein (B)in IL-21-Fc fusion protein by IFA

2.3 rpIL-21-Fc 的纯化效果检测 将真核表达质粒pcDNA-IL-21-Fc 转染293T 细胞后通过亲和层析法纯化转染上清中的目的蛋白。SDS-PAGE 结果显示在分子量44 ku 处有清晰单一的目的条带，大小与预期符合；western blot 结果显示在分子量44 ku处有特异性条带(图3A)。经测定纯化后的rpIL-21-Fc 终浓度为2 150 μg/mL，总体积0.4 mL，即目的蛋白纯化效率为0.86 mg/L 转染上清。

通过ELISA 方法检测纯化的rpIL-21-Fc，结果显示，与空白对照孔相比，包被了rpIL-21-Fc 的孔OD450nm值明显升高，结果呈阳性(图3B)。以上结果表明，获得了纯化的rpIL-21-Fc，且其与鼠抗猪IL-21 MAb 有较好的反应性。

2.4 rpIL-21-Fc 的生物学活性分析 为了验证表达的猪IL-21 的生物活性，分别采用不同浓度纯化的rpIL-21-Fc 与人CD40L 共刺激猪PBMCs，ELISA检测不同刺激条件下IgG 分泌情况；根据猪IgG 标准曲线，计算出各刺激孔中PBMC 上清IgG 含量(图4A)。结果显示，与正常细胞对照组(图4B 中标注“Unstimulated”)或仅CD40L 刺激的对照组相比，纯化的猪IL-21+ 人CD40L 共刺激组中，细胞培养上清中的IgG 分泌明显升高，且呈现一定的剂量和时间依赖性(图4B)，表明该真核表达纯化的rpIL-21-Fc 可以与人CD40L 协同刺激PBMCs 分泌IgG。

图3 纯化的rpIL-21-Fc 的SDS-PAGE (A)、western blot (A)和ELISA (B)检测Fig.3 Detection of purified porcine IL-21-Fc fusion protein by SDS-PAGE (A), western blot (A)and ELISA (B)

图4 rpIL-21-Fc 的活性检测结果Fig.4 Porcine IL-21 and CD40L synergistically induce IgG secretion

3 讨 论

哺乳动物细胞表达系统是实现体外重组蛋白表达的常用手段。与其它表达系统相比，利用该系统表达的外源蛋白具有出色的蛋白质折叠，糖基化修饰，二硫键形成等多种翻译后修饰的特点，更接近天然构象。pcDNA3.1(-)真核表达载体中所含的CMV 和SV40 启动子可以实现外源蛋白的高效表达。IgG Fc 标签的添加便于后续对猪IL-21 的纯化，且其不会影响融合蛋白中目的蛋白的结构与功能，还可以提高目的蛋白在哺乳动物细胞中的表达量[12]。

IL-21 作为一种多效性的免疫调节因子，对B细胞、T 细胞、NK 细胞、DC 细胞等免疫细胞均有不同程度的调节作用。B 细胞的活化需要多种共刺激分子的参与，体外IL-21 单独刺激B 细胞仅能够微弱促进IgM 和IgG 产生，仅用CD40L 刺激B 细胞也仅能产生低水平的IgM 和IgG，而用IL-21+CD40L 共刺激可以强力促进IgM 和IgG 分泌[11]。本研究初步探究了纯化的重组猪IL-21 蛋白的生物学功能，结果显示IL-21 与CD40L 共刺激猪PBMCs，可明显增强猪PBMCs 分泌IgG，该结果与文献报道一致[11]。此外，IL-21 与CD40L 通过STAT3 依赖的信号途径能够上调B 细胞Blimp-1 的表达来协同刺激浆细胞分化和抗体分泌[11]。

临床上，IL-21 的异常表达与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病等自身免疫病的发病机制有关；此外，IL-21 对于控制慢性病毒的感染也很关键[13]，例如IL-21 可以通过下调T 细胞表面一些抑制性受体如PD-1 以及上调某些细胞因子的表达来重塑HBV 特异性的CD8+T 细胞的抗病毒活性[14]，因此其对于慢性乙肝患者体内HBV 的清除至关重要。近年来IL-21 也作为免疫佐剂，广泛应用于疫苗的研发策略中[15]。

综上，本研究中猪IL-21 的表达为进一步利用rpIL-21-Fc 建立体外培养猪B 细胞的方法、以及探究其在T 细胞免疫应答中的作用提供了有力的工具。