上海动物园三种野生禽类新城疫免疫效果评估

王瑛莹 陈晓兰 桂剑峰 朱向蕾 陆旖旎 袁耀华

(上海动物园，上海，200335)

鸡(Gallusgallusdomesticus)新城疫(Neweastle disease，ND)是一种高度接触性致死性传染病，是当前危害禽类最严重的传染病之一，[1-3]，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物疫病。新城疫病毒(NDV)可感染50个鸟目(Aves)中27个目240种以上的禽类，主要感染鸡、鸽(Columbidae)、鹌鹑(Coturnixjaponica)、火鸡(Meleagrisspp.)等[4]。近年来，其宿主范围有扩大的趋势，鹅鸭等水禽也可感染发病[5-6]。因此，应当对新城疫病毒对野生禽类及人类健康的威胁引起重视。

上海动物园圈养野生禽类种类丰富，目前有鸟类近20个目，200余种供游客观赏，且每年会有外来野生鸟类在此栖息。因此，上海动物园具有NDV传播和爆发的风险，应随时监测新城疫疫情，并充分做好免疫防控的监测工作[7-8]。目前，疫苗免疫是防控野禽新城疫的主要措施[9]。上海动物园针对新城疫每年春秋两季对圈养野禽进行疫苗免疫，然而，上海动物园现行免疫程序下现用家禽疫苗对野生禽类的保护作用尚不清楚。为了查明现用NDV疫苗对上海动物园野生禽类的保护效果，本文就上海动物园2017年度野生禽类新城疫疫苗免疫效果进行评估，以期为野生禽类新城疫疾病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

选取上海动物园圈养的3种不同的野生禽类共48只，其中东方白鹳(Ciconiaboyciana)11只，孔雀(Pavospp.)25只，白鹇(Lophuranycthemera)12只。所有的野禽于2017年3月进行新城疫疫苗免疫。

1.1.2 疫苗

鸡新城疫灭活疫苗(CLONE30株)为英特威国际有限公司产品；MA5+CLONE30新支二联弱毒苗由英特威国际有限公司生产。

1.1.3 检测试剂

新城疫血凝抑制试验抗原、阳性血清，均购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。红细胞悬液按照GB/T 18936—2003标准进行制备。

1%鸡红细胞悬液由本实验室制备，具体如下：采集3只无新城疫抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH 7.2的0.01 mol/L PBS液洗涤3次，每次均以1 000 r/min离心10 min，洗涤后用PBS配成体积分数为1%红细胞悬液，4℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 疫苗免疫

采用灭活疫苗肌肉注射和弱毒疫苗点眼免疫的联合免疫方式对野禽进行免疫。具体如下：使用鸡新城疫灭活疫苗(CLONE30株)进行肌肉注射，根据野禽体重大小疫苗接种量为0.5—2 mL/羽；同时使用2头份/羽的免疫剂量点眼免疫MA5+CLONE30新支二联弱毒苗。所有免疫野禽都套上脚标，做好编号。

1.2.2 血清采集

免疫前和免疫后21 d、30 d、60 d、120 d和180 d按时对免疫禽无菌采集血液，分离血清，冷冻保存。

1.2.3 抗体检测

新城疫HI抗体检测按照GB/T 16550—2008新城疫诊断技术标准规定的方法进行血清抗体水平的测定。结果判定：以完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价，只有阴性对照孔效价不大于2 log2，阳性对照孔效价误差不超过1个滴度时，试验结果才有效。按照农业农村部相关标准，新城疫HI效价≥4 log2判为免疫合格。

2 结果和讨论

2.1 血液样品采集程序、疫苗免疫

上海动物园新城疫疫苗免疫程序为每半年免疫1次，分为春季免疫和秋季免疫，两次免疫所使用的疫苗和免疫程序均相同。血液样品采集分为6个时间点，分别在春季免疫前，免疫后21 d、30 d、60 d、120 d和180 d。血液样品采集及免疫程序见图1。

2.2 免疫前和免疫后180 d内新城疫抗体滴度分析

对东方白鹳、孔雀和白鹇的新城疫抗体滴度监测发现，在所有的监测时间点，新城疫抗体滴度个体虽差异较大，但均达到国家要求的最低标准(4 log2)。东方白鹳、孔雀和白鹇总体平均抗体滴度分别为(7.45±1.49)log2、(9.09±1.61)log2和(8.70±1.24)log2。

图1 上海动物园免疫及采血程序Fig.1 The immunization procedure and blood collection point

表1 新城疫病毒抗体滴度检测结果Tab.1 The antibody titers against Newcastle disease virus

续表1

注：“/”表示因样品采集不全未进行检测；抗体平均值表示为：平均值±标准差
Note：“/”Indicates that the test was not performed.The mean value of the antibody titers：mean value±standard deviation

图2 野禽新城疫病毒抗体滴度变化曲线Fig.2 The curve of the NDV antibody titers on wild fowls

2.3 NDV免疫365 d后抗体状态

上海动物园园内展出动物按照现阶段的免疫程序进行接种疫苗，故对展出动物抗体滴度监测最多持续180 d，随后动物即进入下一个免疫程序。为了进一步了解180 d后相关野禽的新城疫的抗体水平，另选取11只孔雀和6只东方白鹳为研究对象，对单次免疫后12个月和15个月的新城疫抗体滴度进行检测(图3A)，具体抗体滴度信息见表2。

表2 免疫365 d后孔雀和东方白鹳抗体滴度Tab.2 The NDV antibody titers of the peacock and Oriental stork over 365 days

图3 NDV免疫后12个月和15个月野鸟抗体滴度分析A.免疫及采血程序；B.孔雀和东方白鹳NDV抗体滴度分析。*表示P<0.05Fig.3 Analysis of antibody titers at 12 and 15 months after immunizationA.The immunization procedure and blood collection point.B.The NDV antibody titers of the peacoke and Oriental stork.*Indicates P<0.05

3 讨论与分析

免疫后应激反应是疫苗效果评价的重要指标之一，疫苗免疫后对本项目中3种野禽(东方白鹤、孔雀和白鹇)的生活状态进行观察，经过连续3周观察发现，新城疫疫苗注射未对野禽的饮食、运动等行为造成较大影响，无野禽死亡。每次采血后，对采血动物进行3—5 d观察，未发现较大的应激反应。

目前，动物园一般都采用灭活苗和弱毒苗联合免疫的方式来预防新城[10-11]。灭活油苗能不断地刺激机体产生高浓度的抗体，且维持时间很长，但刺激机体产生抗体所用的时间需要14—20 d，所以，它引起的抗体空白期长[12]。弱毒苗免疫后能在很短的时间内发生免疫作用，刺激黏膜免疫，但免疫产生的抗体浓度低[13]。温荣辉等[14]报道的孔雀养殖场单独使用ND三价弱毒苗进行免疫免疫后发生新城疫疫情；张玲莉等[15]报道的单独使用新支二联弱毒苗免疫后70 d孔雀的平均抗体滴度是4.7 log2，接近有效保护水平临界值。本研究中弱毒苗和灭活苗联合使用，接种后21 d孔雀抗体滴度是9.93 log2，120 d孔雀抗体滴度是9.27 log2，抗体水平高且均匀，并且免疫期比单独使用弱毒活疫苗要长。这表明上海动物园采用的灭活疫苗和弱毒疫苗联合免疫防控新城疫可行有效。

本研究中，新城疫疫苗免疫后，东方白鹳、白鹇和孔雀新城疫抗体滴度呈现先升高后逐渐降低的过程(图2)。值得注意的是，在相同的疫苗接种程序和类似的饲养条件下，3种野禽新城疫抗体滴度存在较大差异，孔雀的新城疫抗体滴度最高，白鹇次之，东方白鹳新城疫抗体滴度最低，且3种野禽达到滴度峰值的时间是不同的，表明所使用的疫苗对3种野禽免疫效果存在一定差异。

对免疫后3种野禽新城疫抗体滴度横向比较发现，东方白鹳新城疫整体抗体水平明显低于孔雀和白鹳。此外，虽然经疫苗免疫后东方白鹳新城疫抗体均达到国家标准，但东方白鹳65次有效检测中，21次抗体滴度小于或等于6 log2，仅略高于国家标准5 log2。应排查造成东方白鹳新城疫抗体滴度低的原因，并根据原因优化调整东方白鹳的新城疫接种程序。应加强东方白鹳新城疫抗体水平监测并在免疫接种时予以重点关注。

免疫程序的制定是因机体的免疫应答能力而定，经过此次抗体监测可知，不同种属的野禽注射疫苗后，抗体滴度是有差异的。种属间表现出的差异可能与其生理结构和自身的免疫机制不同有关，相关问题还有待深入研究探讨。因此，对于野生禽类来说，若要达到疫苗的免疫效果和有效的保护时间，需针对不同种属制定合理的免疫程序。上海动物园采用的新城疫免疫程序能够使东方白鹳、孔雀、白鹇等野禽产生符合国家标准的抗体滴度。疫苗免疫后180 d，东方白鹳、孔雀、白鹇的新城疫抗体滴度分别为7.13 log2、9.15 log2、7.72 log2；即使免疫后15个月，抗体水平仍然符合国家标准。建议延长两种疫苗的免疫间隔，以减少野禽抓捕和疫苗接种引起的应激反应并降低疾病防控经济成本。