非洲企鹅微卫星DNA的筛选及其遗传多样性分析

袁耀华 耿广耀 杨淑慧 马 跃 徐艳春*

(1.上海动物园，上海，200335；2.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040)

非洲企鹅(Spheniscusdemersus)又名斑嘴环企鹅，与麦哲伦企鹅(S.magellanicus)、加岛环企鹅(S.mendiculus)、洪堡企鹅(S.humboldti)同属企鹅目(Sphenisciformes)，企鹅科(Spheniscidae)，环企鹅属。因为捕杀、捡拾鸟卵、石油污染、沿海生态系统的破坏、不断扩大的商业捕鱼、栖息地丧失、清理鸟粪做肥料等人类活动，导致野外非洲企鹅数量锐减，目前存活数目仅为80年前的2.5%[1]。20世纪末，上海动物园先后从日本、荷兰的动物园引进非洲企鹅进行饲养繁殖，目前已突破人工繁育的技术问题，且建立了较大的饲养种群。在种群发展过程中，主要采用人工配对方式，所以后代的谱系关系不清楚；另一方面，建群者个体数目只有10只，又没有进一步的种源引入，可能存在近亲繁殖。这两种情况都可能导致原本不太高的遗传多样性在今后的继续繁殖中进一步下降。因此，对当前种群的遗传多样性进行系统研究，为种群遗传管理提供依据。目前为止，关于非洲企鹅的研究较少，主要集中在人工繁育技术[2-3]和野外种群波动及其影响因素[4-5]等方面，关于微卫星DNA的筛选及遗传多样研究等方面均未见报道。本研究利用已知的其他企鹅微卫星基因座在非洲企鹅中进行测试，筛选扩增效果良好，且具有较高多态性的微卫星，组成非洲企鹅微卫星分析系统，并用以分析该种群的遗传多样性和遗传结构。

1 材料与方法

1.1 材料

对上海动物园饲养的非洲企鹅种群，除少数个体采用体检所剩的血液样品以外，从每只个体的胸部拔取廓羽3—5枚，装入纸质信封内，通风处自然干燥，然后放入-20℃冰箱内保存。血液样本灌注于无菌的棉纱布中，避光通风处自然干燥，装入纸质信封后放入-20℃冰箱内保存。

1.2 DNA的提取

每只个体取羽毛3枚，将羽轴基部0.5 cm处剪下，置于干净的试管中，在95%的乙醇中震荡漂洗5 min，转入去离子水中漂洗5 min，然后置于TNE缓冲液洗涤中浸泡1 h。采用基因组DNA提取试剂盒(AxyPrep Biosciences，杭州)提取总DNA。干血样品的DNA提取时，先将带血渍的纱布剪下0.5 cm2，置于TNE缓冲液洗涤中浸泡1 h，然后采用相同的试剂盒提取总DNA。提取的DNA经过测定OD260估算浓度，然后稀释成10 ng/μL备用。

1.3 微卫星位点的筛选

从参考文献中[6-9]选择28个微卫星PNN01、PNN03、PNN05、PNN06、PNN07、PNN08、PNN09、PNN012、FHU2、TP500、RM6、RM3、AM12、AM13、AM3、B3-2、G3-11、G3-6、G2-2、H2-6、M1-11、SH1CA9、SH1CA12、SH1CA16、SH1CA17、SH2CA12、SH2CA21和SH2CA22，各位点的重复单元长度为2—4 bp。用文献中的引物和扩增条件扩增非洲企鹅DNA。扩增前，把每个位点上游引物的5′端用FAM荧光染料标记，然后进行PCR扩增。所获得的引物序列、退火温度等信息见表1。

表1 微卫星位点的信息Tab.1 Information of microsatellites used in this study

续表1

PCR反应在50 μL体系中进行，包括25 μL PrimerSTAR Max Premix(2×)(Takara，大连)，上下游引物各0.2 μmol/L，DNA模板50 ng。扩增反应在Eppendorf Master cycler pro PCR仪上完成，98℃/10 s；(98℃/10 s，Ta/15 s，72℃/10 s)× 30 cycle；72℃/1.5 min。PCR产物用ABI 3100型遗传分析仪(Applied Biosystems，美国)电泳分离，用GeneScan 3.1软件(Applied Biosystems，美国)收集数据，用Genotyper 3.1软件(Applied Biosystems，美国)测量扩增产物大小，并识别等位基因。

1.4 数据分析

利用软件Cervus 3.0对基因型数据进行分析，得到观测杂合度、期望杂合度、等位基因数、有效基因数、基因频率、基因型频率、排除率、个体识别力、亲权分析等。利用软件PopGene对该群体每个位点的Hardy-Weinberg平衡进行卡方(χ2)检验，利用Coancestry估计该圈养种群的近交系数。

2 研究结果

2.1 微卫星遗传多样性

相比血液样品，羽毛样品的总DNA提取量较少，但是所有的样品都足够用于微卫星扩增。实验发现，28个微卫星中有17个在非洲企鹅上无扩增产物，包括PNN07、PNN08、FHU2、TP500、RM3、AM12、AM13、AM3、G3-11、G3-6、M1-11、SH1CA9、SH1CA12、SH1CA16、SH1CA17、SH2CA12和SH2CA22，其余11个有扩增产物，但PNN05、RM6和H2-6等3个位点表现为单态，PNN01、PNN03、PNN06、PNN09、PNN012、G2-2、B3-2和SH2CA21 8个位点具有多态性。

在46个个体中，上述8个多态位点上共检测到34个等位基因(表2)，每个位点的等位基因数为3—6个，平均4.25个。等位基因数最多的是PNN03，共检测到6个等位基因，其次是PNN06、PNN012和SH2CA21，均检测到5个等位基因。在PNN09检测到4个等位基因，PNN01、G2-2和B3-2各检测到3个等位基因。有效等位基因数在PNN09最大，为3.56；B3-2最小为1.57，平均为2.71个。8个多态位点的观测杂合度为0.435—0.804，平均为0.614；期望杂合度0.366—0.726，平均为0.618。8个位点中，多态性信息含量在0.330—0.667，PNN09最高为0.667，B3-2最低为0.330。通过χ2检验发现，8个多态位点中PNN03显著偏离Hardy-Weinberg平衡，PNN01偏离Hardy-Weinberg平衡，其他6个位点均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2 非亲排除率与亲权鉴定

依据各位点的基因频率、基因型频率计算各位点的非亲排除概率(NEP)，各位点非亲排除概率和累计排除概率见表3。对第一亲本的非亲排除概率为0.707—0.935，对第二亲本的非亲排除概率为0.536—0.814，对亲本对的非亲排除概率0.362—0.690。 8个多态位点双亲累计排除概率(E-PP)为0.998。

通过Cervus 3.0软件，共鉴定出15对父-母-子，包括31个个体。据此绘制了3个谱系关系(图1)。

2.3 个体杂合度与个体近交系数

根据各个体的基因型，计算个体杂合度与标准个体杂合度，由表4可以看出该圈养种群个体杂合度为0.250—1.000，标准杂合度为0.405—1.618。利用Coancestry采用LH-estimator和LR-estimator两种估计方法估计个体近交系数，该圈养种群的个体近交系数的范围为-0.304—1.617(LH-estimator)和-0.402—0.750(LR-estimator)，二者的平均值分别为0.045和0.052，从数值上看，该群体既存在近交，同时也存在明显的近交避免机制。

表2 人工饲养非洲企鹅种群中8个微卫星位点的遗传特征Tab.2 Characteristics of 8 microsatellites in the captive African penguin Spheniscus demersus population

表3 人工饲养非洲企鹅种群中8个微卫星位点的非亲排除概率Tab.3 Non-parent exclusive probabilities of 8 microsatellites in the captive African penguin Spheniscus demersus population

图1 人工饲养非洲企鹅31只个体的谱系关系图Fig.1 The pedigree chart of 31 captive African penguins

表4 个体杂合度与标准个体杂合度Tab.4 Multilocus heterozygosity and standard multilocus heterozygosity

3 讨论

鸟类取样一般分为3类：伤害性取样、非伤害性取样、非损伤取样。伤害性取样即杀害动物采样或抽取1 mL以上的血液，一般不适用于珍稀鸟类。本研究采用非伤害性取样拔取胸部廓羽和体检剩余血液作为研究对象，虽然血液样本中总DNA含量远高于廓羽中总DNA含量，但在遗传多样性分析中胸部廓羽DNA含量和血液DNA未因含量变化发生差异。在以后相关研究中采样可以采用非伤害性取样，尽可能避免应激对动物的伤害。

该研究选取了28个微卫星引物，经过一系列的筛选最终确定了8对具有多态性的引物。其中PNN01，PNN03，PNN06，PNN09，PNN012来源于非洲企鹅，再次证实了这5个位点在非洲企鹅中的稳定存在，其中PNN012扩增率较其他几个位点略低，在以后的非洲企鹅相关研究中应该慎重考虑。SH2CA21来源于洪堡企鹅，在非洲企鹅群体中有较好的遗传多态性，具有一定的研究价值，对以后洪堡企鹅和非洲企鹅的物种进化研究起到一定的作用。B3-2和G2-2是通过磁珠富集法获得的位点引物，在麦哲伦企鹅和加岛环企鹅种群成功扩增且有较高的多态性，本研究也证实了该位点在非洲企鹅种群中的普遍存在。SH2CA21，B3-2，G2-2位点有较好通用性，有助于企鹅目的比较遗传图谱的构建。

有效等位基因数是群体随机交配能够稳定遗传给后代的基因数，等位基因数反映的是该位点的遗传变异水平，一般等位基因数越大，该基因适应环境变化的潜力也越大。有效等位基因数和观察等位基因数的差值可以反映该位点等位基因丢失的风险。8个多态位点的等位基因数为3—6，平均4.25，有效等位基因为1.57—3.56，平均2.71。观察等位基因数和有效等位基因差距较大，说明上海动物园非洲企鹅种群中有部分低频等位基因有丢失的风险。Hardy-Weinberg平衡检验显示PNN03、PNN01显著偏离Hardy-Weinberg平衡，占总位点数的25%，与现用非随机配对方式有关。其他6个位点未偏离Hardy-Weinberg平衡这说明现用配对方式对当前遗传多样性的影响还比较小，此时为加强遗传管理的好时机。

采用此套遗传标记利用Cervus 3.0软件在亲本未知情况下，鉴定出了15组血缘关系，其他个体未能成功检出亲缘关系，这可能是由亲本信息未采集导致。在以后种群管理中适当增加携带稀有基因(P<0.05)个体的繁殖机会，以期稀有基因得以保留。

4 结论

位点PNN01、PNN03、PNN06、PNN09、PNN012、G2-2、B3-2和SH2CA21多态性较高，且累积非亲排除率也较高，可以用于谱系勘误、亲权分析，在利用该研究遗传标记进行遗传管理时，需配合SPARKS和PMX等软件。在条件允许的情况下，对未确定基因指纹的个体进行个体基因指纹制定，此外单个位点非亲排除率较低，可以进一步寻找更多的位点提高实验的准确性。