五种基于CHD基因的性别鉴定方法对雀形目鸟类有效性的实验评估

苏 倡 李显达 邢晓莹 李 波，3 马 跃，3 吴 伟 徐艳春，3*

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040；2.黑龙江中央站黑嘴松鸡自然保护区管理局，嫩江，161499；3.国家林业和草原局野生动植物检测中心，哈尔滨，150040)

性别鉴定是鸟类研究工作的一项基础工作[1]，在种群监测、行为研究、性比分析、婚配系统分析、引种繁育、饲养管理、疾病防治和遗传进化等诸多方面都具有十分重要的作用[1-2]。全世界现存的9 800多种鸟类中有50%的物种是单态型鸟类[3]，表现为雌雄体色十分相似，通过羽色、体尺等形态学指标判定其性别比较困难。人们根据经验建立了一些方法来判别单态型鸟类的性别，例如：体尺测量、鸣声判定、翻肛鉴别、腹腔镜检、类固醇鉴定和核型分析等[2]。这些方法中，如体尺、鸣声、类固醇水平等方法可靠性差；翻肛鉴别、腹腔镜检和核型分析等方法要么耗时长，价格昂贵，操作过程繁琐，要么对鸟类健康带来伤害，甚至危及生命[4-5]。鸟类性别鉴定的困难为鸟类学研究和监测工作带来了很多不便[6]。

鸟类性染色体上存在着哺乳动物对应的染色体螺旋蛋白结合基因(CHD)[7]，该基因在Z染色体和W染色体上的同源序列之间外显子高度保守，而内含子序列和大小差异很大[7]。由于大多数鸟类性染色体表现为雄性同配(ZZ型)、雌性异配(ZW型)，所以雄鸟只有CHD-Z基因，而雌鸟有两个同源拷贝即CHD-Z和CHD-W[3]。根据这个特性，在内含子两侧的保守序列上设计PCR引物，Z染色体和W染色体上的扩增产物会表现出片段大小的差异，借此可判断鸟类性别[3，8]：有一个条带的为雄性个体，有两条大小不同条带的为雌性个体。

根据这一原理，Griffiths等设计了鸟类性别鉴定引物P2、P3，通过PCR扩增的方法成功鉴定了野生金刚鹦鹉(Cyanopsittaspixii)的性别[9]。因为这一鉴别采用的 PCR策略具有鉴定快速、特异性高、通用性高、取材容易且采样量小等优点[10]，在后来的鸟类性别鉴定中被广泛采用[11]。

雀形目(Passeriformes)有5 700余种，占全世界现存鸟类种数的60%[12]，单态型鸟类很多，通过体色和体型等外部特征鉴定其性别比较困难。因而，CHD基因的PCR方法就成为单态型鸟类性别鉴定的主要方法[11，13-15]。但是由于雀形目种类繁多、适应辐射极广[16]，且数量庞大，所以基因的变异较多，经常因为PCR引物通用性不够而导致部分物种甚至部分个体的CHD基因很难扩增[17]。目前，文献报道较多的有5对CHD基因通用引物用于雀形目鸟类性别鉴定，包括P2/P8[3]、2550F/2718R[18]、CHD1F/CHD1R[15]、sex1’/sex-mix[11]和IntP2/IntP8[17](表1)。文献中都明确阐述了这些方法的有效性，但在实际工作中，效果并不很理想。在森林鸟类环志和种群监测中，主要单态型雀形目鸟类采用这些方法是否有效还不清楚。本研究以柳莺科(Phylloscopidae)、鹡鸰科(Motacillidae)和岩鹨科(Prunellidae)鸟类为对象，评估了上述5对引物在其性别鉴定中的有效性，为这些鸟类种群性别结构分析提供借鉴。

表1 5对引物成功鉴定性别的雀形目鸟类信息Tab.1 Application of five universal PCR primer pairs of CHD gene for sexing Passerine birds

续表1

注：文献中一些种类的科的划分与《中国鸟类分类与分布名录》(第三版)[20]稍有差异
Note：Family affiliation of some species in these cited literatures is different from the present used taxonomy described inAChecklistontheClassificationandDistributionoftheBirdsofChina(third edition)[20]

1 材料与方法

1.1 材料

实验所需样品大部分来自黑龙江高峰鸟类保护环志站(49°06′N，125°15′E)和东北林业大学帽儿山鸟类环志站(45°24′N，127°39′E)。在鸟类环志工作的同时，采用雾网捕捉的方法在野外捕捉雀形目鸟类共6种214只，分别为树鹨(Anthushodgsoni)20只、棕眉山岩鹨(Prunellamontanella)35只、黄眉柳莺(Phylloscopusinornatus)76只、黄腰柳莺(Ph.proregulus)36只、褐柳莺(Ph.fuscatus)20只和灰脚柳莺(Ph.tenellipes)27只。这6种鸟类均为单态型，表现为雌雄同色[21]，依靠形态学方法不能有效区分其性别。环志过程中，将鸟从雾网上取下，完成戴脚环、体尺测量、称重、记录后，用洁净的镊子从其胸腹部不同位置拔取3—5根廓羽[5，22]，不影响其体形轮廓，然后放飞。将羽毛置于纸质样品袋中，标记采集时间、环号等信息，室温干燥保存。此外，国家林业和草原局野生动植物检测中心惠赠了20只柳莺科及棕眉山岩鹨死体(表2)。将每只个体剖开腹腔，探查卵巢和睾丸等器官，判断其性别，然后采集肌肉组织少许，提取DNA，考察每对引物扩增的正确性。

表2 20只性别鉴定阳性对照鸟类信息Tab.2 The information of 20 birds used as positive control in sexing experiments

1.2 总DNA的提取与PCR扩增

用灭菌的解剖剪剪取羽毛基部2 mm[5，22]，置于1.5 mL离心管中，加入消化液：310 μL TNE buffer(pH=8)、20 μL蛋白酶K(10 mg/mL)、20 μL 1mol/L DTT，56℃恒温消化过夜，直至羽根完全溶解，用DNA提取试剂盒(AxyPrep Biosciences，杭州)提取总DNA。提取肌肉组织的DNA时，取肌肉组织 50 mg 于1.5 mL 离心管中，用灭菌的眼科剪将其剪成碎块，依次加入消化液：295 μL TNE buffer(pH=8)、25 μL蛋白酶K(10 mg/mL)、35 μL 10%SDS溶液，56℃水浴消化1 h以上，再用相同的方法提取总DNA。

提取的DNA用NanoPhotometer-N50超微量紫外分光光度计(德国Implen公司)测量浓度，统一稀释到约10 ng/μL的浓度备用。

PCR反应在10 μL体系中进行，包括正反向引物各0.2 μL(10 μmol/L)、2×EasyTaq SuperMix(Transgen，北京)5 μL、ddH2O 1.8 μL、DNA模板3 μL。阴性对照采用ddH2O为模板，其余组分完全相同。扩增采用PE-9700型DNA扩增仪(PE，美国)，反应程序为94℃/3 min预变性，94℃/30 s再变性，50℃/45 s退火(P2/P8，CHD1F/CHD1R，2550F/2718R退火温度为48℃，sex1’/sex-mix退火温度为50℃，IntP2/P8退火温度为51℃，退火温度也会因物种不同而做适当调整)，72℃/50 s延伸，共循35次，最后72℃延伸10 min。扩增产物用2.8%的琼脂糖凝胶电泳分离(80V稳压，1 h)，以DL1000 marker和DL2000 marker(Takara)为分子量标准估算扩增产物的大小，用凝胶成像仪拍照并记录实验结果[11]。

为了评估5对引物扩增的灵敏度，在性别已知的5种20只鸟类中找出同时满足以下两个条件的物种：一是该物种至少包含雌雄两个个体，二是5对引物均能稳定扩增这两个体的DNA。最终选定编号为10#和11#的褐柳莺雌雄个体。将其DNA稀释为7个浓度梯度，分别是20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL以及1 pg/μL。在10 μL的体系中，DNA模板的最终浓度分别是2 ng/μL、1 ng/μL、500 pg/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL以及0.1 pg/μL。用同样的电泳方法记录扩增结果。

2 结果

2.1 5对性别鉴定引物鉴定的正确率和成功率

用5对引物对性别已知的20只鸟类的DNA进行PCR扩增，比较PCR鉴定和解剖学鉴定的结果是否一致。结果如表3，P2/P8、sex1’/sex-mix和IntP2/IntP8在20只个体中的扩增成功率为100%，2550F/2718R有1只个体没有成功扩增，成功率为95%，CHD1F/CHD1R扩增的成功率最低，仅为70%。在正确率上，CHD1F/CHD1R、sex1’/sex-mix和IntP2/IntP8都有1只个体的PCR性别判定结果与解剖学判定的不同，错误率为95%。P2/P8和2550F/2718R 的错误率较高，分别为20%和15%。因此，sex1’/sex-mix和IntP2/IntP8的正确率和成功率最佳。

表3 5对引物性别鉴定的正确率Tab.3 Sexing correctness of five pairs of primers

2.2 5对引物PCR体系的灵敏度

灵敏度测试结果如图1、表4。引物P2/P8的体系在较高的DNA浓度条件下扩增产物电泳结果比较清晰、准确，呈现出雌性为2个条带，雄性为1个条带。但是当DNA浓度降低时，即使同一样品，重复实验时PCR扩增效果也不稳定，当模板DNA终浓度低于500 pg/μL时便无扩增产物检出。这一结果也与以往的一些研究相符[11]。引物CHD1F/CHD1R和2550F/2718R扩增体系的灵敏度相似，都表现出雄性单条带，雌性双条带。虽然在模板DNA浓度在10 pg/μL时也有扩增产物出现，但100 pg/μL以后扩增就不够稳定，电泳条带经常很淡，甚至不易辨认。引物sex1’/sex-mix体系的效果最好，扩增产物稳定，电泳结果清晰、准确。同时，在10 pg/μL的低浓度DNA条件下仍能显示出微弱但清晰可辨的条带。引物IntP2/IntP8扩增效果也很好，在100 pg/μL的DNA浓度下条带显示良好，但模板浓度低至10 pg/μL时则没有扩增条带。以上结果表明，引物sex1’/sex-mix扩增体系的灵敏度最高，IntP2/IntP8次之，CHD1F/CHD1R和2550F/2718R居中，P2/P8最差。

2.3 5对引物扩增成功率的大样本测试

根据灵敏度测试结果，在10 μL PCR反应体系中，采用10 ng DNA模板，在保证各对引物能够稳定扩增的前提下，用6个物种214只个体的大样本评估每对引物扩增的成功率。

如表5所示，引物P2/P8和CHD1F/CHD1R总扩增成功率仍然很低，均低于60%。P2/P8扩增片段长度为300—400 bp，在W染色体上扩增片段大于Z染色体的扩增片段；CHD1F/CHD1R与P2/P8相反，在CHD-W的扩增片段小于CHD-Z的扩增片段，两片段长度范围约为300—600 bp。

引物2550F/2718R扩增片段长度约为500—700 bp，CHD-W的扩增片段小于CHD-Z扩增的片段，总成功率为85%。但其W染色体扩增产物的条带经常不太清晰，表明2个片段扩增效率不平衡。使用该对引物扩增树鹨DNA时，除CHD-W和CHD-Z基因的扩增产物外，几乎所有个体均有1条250 bp左右的非特异性条带，但该条带对性别判定没有影响。

表4 5对性别鉴定引物扩增体系灵敏度的测试结果Tab.4 Sensitivity of PCR systems of five primers pairs for sex identification

图1 不同模板浓度下5对引物扩增体系的灵敏度Fig.1 Sensitivity of five pairs of primers amplifying a series of template concentrations 注：各电泳图中，奇数泳道为10#♀，偶数泳道为11#♂。模板浓度1、2泳道 为2 ng/μL；3、4泳道为1 ng/μL；5、6泳道为500 pg/μL；7、8泳道为100 pg/μL；9、10泳道为10 pg/μL；11、12泳道为1 pg/μL；13、14泳道为0.1 pg/μL；15泳道为阴性对照(ddH2O)；M：marker DL2 000(TaKaRa) Note：In each electrophorogram，odd lanes are sample 10#♀ and even lanes are sample 11#♂.The concentrations of template are：Lane 1 and 2：2 ng/μL，Lane 3 and 4：1ng/μL，Lane 5 and 6：500 pg/μL，Lane 7 and 8：100 pg/μL，Lane 9 and 10：10 pg/μL，Lane 11 and 12：1 pg/μL，Lane 13 and 14：0.1 pg/μL.Lane 15 is negative control(ddH2O).M：marker DL2 000(TaKaRa)

引物sex1’/sex-mix的总扩增成功率97%，两个扩增产物的电泳条带均比较清晰。两片段长度为250—300 bp，CHD-W扩增片段大于CHD-Z扩增片段。但部分黄眉柳莺雌性个体的CHD-W片段有优先扩增现象，致使一部分个体的电泳图上所见CHD-Z片段条带偏粗或在250 bp大小的区段存在2条相距很近的条带。

引物IntP2/IntP8总扩增成功率63%，CHD-W扩增片段大于CHD-Z扩增片段，两片段长度为250—300 bp。

3 讨论

性别鉴定中，某种方法是否具有实用意义主要看3个方面的表现：鉴别的正确率、PCR反应的灵敏度和鉴别的成功率。正确率显然是第一重要的，一种方法不能有足够高的正确率，将会对种群性比的估算带来偏差，如果选择繁殖个体，则可能错误地选择了同性个体。正确率未知的情况下，这些偏差是无法纠正的。

本研究的评估显示，在20只已知性别的个体中，引物sex1’/sex-mix和IntP2/IntP8的正确率最高，均达到了95%，引物P2/P8和2550F/2718R次之，均为80%，而引物CHD1F/CHD1R的正确率最低，仅有65%(表2)。这些错误主要来自CHD-W或CHD-Z基因其中的一个扩增失败，未出现假阳性扩增的现象。这说明，正确率低的原因更有可能是在引物区的碱基变异没有包含在引物中，如果采用简并引物来包含这些变异，可能会有所改善。就目前对所测试的雀形目鸟类来说，sex1’/sex-mix和IntP2/IntP8是比较可靠的。

灵敏度是反应体系能够扩增出来的最低模板量。一个体系的灵敏度越高，就越可能节省模板，越适合于微量材料。羽毛是DNA含量较低的材料，与肌肉和血液样本不同，从羽毛样品得到的总DNA浓度通常较低[23]，所以越灵敏的PCR体系，在实际应用中越有价值。

本研究评估显示，5对引物中引物sex1’/sex-mix的灵敏度最高，达到10 pg/μL，IntP2/IntP8次之，为10—100 pg/μL，CHD1F/CHD1R和2550F/2718R为100 pg/μL，P2/P8最差，仅为500 pg/μL(表4)。体系的灵敏度主要取决于引物的摩尔数与模板DNA和目的片段的摩尔数之比。反应体系中，引物的摩尔数是确定的，而模板DNA目的片段的摩尔数存在一定的不确定性。因为DNA会发生化学降解和机械剪切，机械剪切往往容易发生在较大片段的中部，而酶促降解则较多发生在特定的位置。因为不同样品保存条件不同，所经历的机械剪切和酶促降解也有所不同，因此，体系中虽然加入等量的模板DNA，但不同样品的反应中DNA片段数和保留完整的目的片段数都有所差异。从表4可以看出，如果DNA较少的时候，引物sex1’/sex-mix的表现最优，IntP2/IntP8次之。

表5 5对性别鉴定引物扩增成功率Tab.5 The success rate of five primers pairs for sex identification

成功率是除了正确率以外最为关心的问题。一个PCR体系能否扩增成功，除了引物质量和浓度、酶活力、离子强度、体系pH及缓冲能力、反应程序及执行质量等因素以外，单纯从模板因素考虑，引物区的变异度是第一大影响因素。越是靠近引物3′端的变异越容易导致PCR失败，直接降低成功率。对于雀形目鸟类，遗传多样性较高，种群内的变异度较高，CHD基因不同区段的变异度不同[24]。在不同区段上设计引物，受到的影响程度就会不同。我们采用大样本测试发现，引物sex1’/sex-mix的总扩增成功率最高，达到97%；引物2550F/2718R次之，达到85%；其余3对引物的扩增成功率仅在63%或更低。

综上所述，从鉴定正确率、反应体系灵敏度和鉴定成功率3个指标组合分析，对树鹨、棕眉山岩鹨、黄眉柳莺、黄腰柳莺、褐柳莺和灰脚柳莺这6种单态型鸟类，引物sex1’/sex-mix是性别鉴定的最优选择，引物IntP2/IntP8和2550F/2718R可以慎用，而引物P2/P8和CHD1F/CHD1R不建议使用。