一种快速检测黄曲霉毒素B1的方法

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(1．山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/山东省食品质量与安全检测技术重点实验室，济南 250100；2．青岛新光智源环境科技有限公司，青岛 266011；3．山东省计量科学研究院，济南 250014；4.山东大学，济南 250014；5.中国测试技术研究院，成都 610212)

黄曲霉，常出现在发霉粮食、粮制品及其它霉腐有机物上的一种腐生真菌[1]，其代谢产生的黄曲霉毒素具有强烈的毒性以及致癌、致畸、致突变性[2，3]。黄曲霉毒素的毒性相当于氰化钾的 10 倍，砒霜的 68 倍，二甲基亚硝胺的70倍，并且已经被国际癌症研究组织确定为I类致癌物[4，5]。黄曲霉毒素现已被分离鉴定出20多种，其中常见的有B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG2)、M1(AFM1)、M2(AFM2)6种[6]，而在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强[7]。鉴于黄曲霉毒素的严重危害，为杜绝食品安全问题，保护人体健康，我国对黄曲霉毒素有严格的检出标准。《GB2761-2011》要求对玉米、玉米面、玉米制品、花生、花生制品及花生油中的黄曲霉毒素含量不高于20μg/kg；稻米、糙米、大米及植物油类(花生油除外)中不高于10μg/kg；小麦与大豆及其制品、熟制坚果、酱油等调味品中不高于5μg/kg；婴幼儿配方食品要求更为严格，毒素含量必须低于0.5μg/kg。

目前，检测黄曲霉毒素的方法主要有色谱法、酶联免疫法和色谱串联质谱法[8-10]。现在应用最广泛的是液相色谱法，由于B1和G1遇水发生荧光猝灭，因此需要进行衍生来提高其灵敏度[11]。柱后光衍生是最常见的一种衍生方法，相对于柱前衍生和柱后碘衍生，柱后光衍生具有使用方便、准确、无任何毒害作用、对仪器损伤小等特点[12]。因此，柱后衍生已经成为近年来实验室检测黄曲霉毒素的主流方法。新光智源环境科技有限公司研发的AIC80黄曲霉毒素专用仪，其配备的荧光检测器即内置有光化学衍生系统，其使用寿命高达20000小时，是常规进口设备的7倍[13]。系统中检测器配用小功率LED光作为激发光源，其功率小，使用寿命在15000～20000小时左右，相比传统的氙灯长5～6倍；自制的AccuOpt光电放大组件作为为接收器件，相比光电倍增管，具有抗电磁干扰，强光免疫，启动时间快的特点；其流通池体积0.1 mL，相比进口的1 mL衍生池，能够大大降低峰展宽，提高灵敏度。基于此款新开发的国产黄曲霉毒素专用测试仪，本文研发出一种快速检测面粉、饲料、奶粉、莲子等食品中黄曲霉毒素B1含量的有效检测方法，该方法简单易操作、灵敏度和准确度高，可为科研院所、检测机构或生产企业等单位提供精准测量黄曲霉毒素提供参考方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1仪器

AIC80黄曲霉专用仪(新光智源环境科技有限公司)，配有LED光源的荧光检测器和光衍生器；SB-5200D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；漩涡振荡器(Vortex-Genie-2 上海思博明有限公司)；纯水机(四川优普超纯科技有限公司)；氮吹仪(DN-12A-DC 天津东康科技有限公司)；高速冷冻离心机(美国贝克曼公司)；电子天平(AL104，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

1.1.2试剂

乙腈(色谱纯，德国默克公司)；甲醇(色谱纯，德国默克公司)；226多功能净化柱(上海Romer有限公司)；免疫亲和柱(上海Romer公司)；黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2标准品(2.6μg/mL ，Aflatoxin Total solution in Acetonitrile，上海Romer公司)。

1.2 色谱条件

色谱柱：CNW Athena C18-WP(4.6×150mm，5μum)；柱温：45℃；进样量：25μL；检测波长为：激发波长360nm，发射波长440nm；流动相：甲醇∶水=45∶55；流速1mL/min

1.3 前处理过程

1.3.1免疫亲和柱法

(1)提取：取5g样品(饲料、药品等样品需粉碎)于50mL离心管中，加20mL甲醇-水(体积分数6∶4)，放置超声波中超声20min，6000r离心7min，取离心后上清备用。

(2)净化：取上述样液5mL移至50mL加水或缓冲盐溶液定容，上样过柱，控制过柱速度，使液体缓慢稳定下滴；待样液滴完后，再加入10mL水淋洗，弃去淋洗液，抽干亲和柱。加入2mL甲醇洗脱亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。

(3)浓缩：在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用初始流动相定容至1. 0mL，涡旋30s溶解残留物，0. 22μm滤膜过滤，待上机。

1.3.2226多功能净化柱法

(1)提取：称取5g样品(饲料、莲子等固体样品粉碎至粒径1mm以下)放于50mL离心管中，加入20mL乙腈提取液混匀。10000r/min以上高速均质1min，超声提取30min，7500r/min离心机离心20min后收集上清液。

(2)净化：将5mL样品提取液注入试管中，再将净化柱放入试管中并下压提取液，上渗的样品即为净化后样品，可将其转移纸EP管中。

(3)浓缩：取2mL净化提取液，氮吹至干，用1mL初始流动相复溶，过微孔滤膜，上机分析。

2 结果与分析

2.1 前处理方法比较

食品中检测黄曲霉毒素的前处理净化一般采用用免疫亲和柱或多功能净化柱[14,15]。本实验选用这两种前处理小柱进行同一种样品的检测比较，结果如图1所示。由M和N谱图可以看到该莲子经过两种小柱处理的样品都未检测出黄曲霉毒素(G2、G1、B2、B1)，说明实验中所处理的莲子较为新鲜，还没有发生自然霉变，无黄曲霉菌的生长；m、n谱图是前处理后样品液加标相同含量B1毒素(2μg/kg)后所测，可以看到226净化柱处理的样品中毒素B1响应值(5.811mV)高于免疫亲和柱所处理样品中的B1响应值(4225mV)，表明前者对样品中杂质具有较好的清除作用，从而减小检测器对相应的黄曲霉毒素的影响程度，得到更好的检测效果。图1中各谱图停留时间在5 min之前的峰均为样品杂质峰，226净化柱处理的样品谱图N、n相比免疫亲和柱所处理样品谱图M、m，杂质峰种类少且含量(响应值)明显低，说明了226净化柱较好的除杂效果，与前面的结论相契合。

图1 不同前处理方法下的莲子样品实测和加标谱图M，m分别代表免疫亲和柱处理的真实样品和加标2μg/kg B1的谱图；N，n分别代表226净化柱处理的真实样品和加标2μg/kg B1的谱图

2.2 样品衍生和非衍生对比

食品中检测黄曲霉毒素的前处理净化一般采用用免疫亲和柱或多功能净化柱。本实验选用这两种前处理小柱进行同一种样品的检测比较，结果如图1所示。由M和N谱图可以看到该莲子经过两种小柱处理的样品都未检测出黄曲霉毒素(G2、G1、B2、B1)，说明实验中所处理的莲子较为新鲜，还没有发生自然霉变，无黄曲霉菌的生长；m、n谱图是前处理后样品液加标相同含量B1毒素(2μg/kg)后所测，可以看到226净化柱处理的样品中毒素B1响应值(5.811mV)高于免疫亲和柱所处理样品中的B1响应值(4225mV)，表明前者对样品中杂质具有较好的清除作用，从而减小检测器对相应的黄曲霉毒素的影响程度，得到更好的检测效果。图1中各谱图停留时间在5 min之前的峰均为样品杂质峰，226净化柱处理的样品谱图N、n相比免疫亲和柱所处理样品谱图M、m，杂质峰种类少且含量(响应值)明显低，说明了226净化柱较好的除杂效果，与前面的结论相契合。

前述2.1中所示检测谱图皆为黄曲霉毒素化学衍生后的检测结果，而对于不进行化学衍生，该仪器与方法是否还仍有效果也进行了考量。M和m即为饲料样品226净化柱处理的有衍生和无衍生后的样品检测谱图。可以看到，是否衍生对黄曲霉毒素G2、B2的检测效果无明显影响，因为二者有相似的响应值。而对于毒素G1和B1，经过衍生后的样品相应响应值明显居高，检测灵敏度优异；未经衍生的样品毒素B1虽然响应值偏低，但峰型明显，也能实现较为有效的定性和定量。因为在黄曲霉毒素众多的组分中B1毒性最强[7]，B1值的大小可代表食品中黄曲霉毒性的强弱，所以，非衍生操作也有其一定的可行性(图2)。

图2 净化柱前处理下的饲料样品衍生(M)和非衍生(N)谱图

2.3 线性及检出限

由于B1是黄曲霉毒素中的典型成分，本实验配制了一系列梯度浓度的B1标液，通过柱后衍生测得结果如表1所示。以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标，制得标准线性曲线如图3所示。在B1浓度范围0.01～20μg/kg内，线性方程Y= 45340X- 7780，相关系数r为0.999873，说明该方法线性良好，仪器检测状态优良。

表1 黄曲霉毒素B1系列标准样品浓度及响应值

选择空白样品(高纯去离子水)，定量添加黄曲霉毒素B1，测得仪器的最低B1检出浓度为0.1μg/kg，根据其相应的响应值(0.221 mV)，在信噪比为3，噪声0.05 mV的基础上计算得到检出限为0.007 μg/kg，远远优于国标GB5009.22-2016中的0.03μg/kg。

图3 黄曲霉毒素成分B1标准曲线

2.4 定量重复性验证

为检测仪器的稳定性，配制5μg/kg的黄曲霉毒素B1标样，连续进样7针，得到的检测结果如表2所示，其相对标准偏差为0.69%，远远小于国家标准的2.5%，说明该仪器在现有的检测条件下具有优异的检测重复性，精密度良好。

2.5 加标回收率

对4种实际样品(莲子、饲料、酸枣仁、远志中药)按照226多功能净化柱前处理步骤进行净化后检测，4种样品中都未检测出黄曲霉毒素。加标2 μg B1，得到的具体检测结果如表3所示。可以看到，每种样品的加标回收率都在80%～90%之间，方法准确度良好。

表2 5 μg/kg黄曲霉毒素B1连续进样测试结果

表3 样品中黄曲霉毒素B1加标测试结果

3 结论

基于新光智源环境科技有限公司研发的AIC80黄曲霉毒素专用仪，建立了一套快速检测面粉、奶粉、饲料、中药等食物中黄曲霉毒素的方法。该方法使用的226多功能净化柱对样品基质清除效果优异，柱后光化学衍生技术下的黄曲霉毒素检测灵敏度高。黄曲霉毒素B1在0.01～20μg/kg内线性关系良好，同一样品重复性检测值的相对标准偏差为0.69%，不同样品的加标回收率在80%～90%之间，仪器定量重复性好，符合相应国标要求。