超声萃取-高效液相色谱法同时测定彩泥中9种防腐剂

胡 伟 马俊辉 张晓飞 徐 文2 周良春 李双琦 赵文隆

(1.成都产品质量检验研究院有限责任公司，成都 610100；2.成都市新都区石犀小学，成都 610500)

彩泥(造型粘土)是一类集趣味性、知识性与科学性于一体的新型益智类玩具，主要分为以下两类：一类是传统彩泥，主要由面粉、防腐粉、香精、食用油、色素、盐、保湿剂、水、颜料或染料按比例混合搅拌制成；一类是造型黏土又名轻质彩泥、太空粘土、跳跳泥、棉花泥，主要运用纸浆或高分子材料发泡粉(真空微球)进行发泡，再与聚乙烯醇、胶黏剂、甘油、颜料(染料)等材料按照一定比例物理混合制成[1，2]。为延长彩泥制品的使用和贮存寿命，防止细菌的产生，部分生产企业可能禁用添加防腐剂等化学助剂，此类化学助剂具有致敏性与致癌性，幼儿长期接触或误食易对身体健康造成潜在危害[3-7]。

彩泥(造型粘土)产品标准为QB/T 2960-2008《彩泥》，其仅对防腐剂游离甲醛进行限量(限量值为0.05%)[8]。欧盟标准EN 71-9:2005+A1:2007《玩具安全 第9部分 有机化合物限值要求》针对彩泥中游离甲醛、苯酚、甲基异噻唑啉酮(CAS:2682-20-4)等7种防腐剂进行限量[9]。欧盟玩具安全指令2009/48/EC中新增的4种玩具中防腐剂物质限制(甲基氯异噻唑啉酮(CMI)要求低于0.75mg/kg，甲基异噻唑啉酮(MI)要求低于0.25mg/kg，CMI与MI的3∶1比例混合物要求低于1mg/kg，苯并异噻唑啉酮(BIT)要求低于5mg/kg)已于2017年11月24日全部生效[10]。对羟基苯甲酸酯类防腐剂广泛用于食品、包装、药品和化妆品等，包括对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、异丙酯和异丁酯，与乳腺癌发病有关且具有雌激素活性[5,11-13]。

目前，关于防腐剂的研究较多，常用的防腐剂苯甲酸、苯甲醇、甲基异噻唑啉酮与对羟基苯甲酸酯类，主要用于化妆品、食品药品、食品接触材料等[2-5,14-17]。国内至今未对彩泥制品中防腐剂的类别与限量未做出明确规定。基于防腐剂的严重危害，为保证彩泥制品的安全，有必要控制防腐剂的使用与用量。利用超声萃取-高效液相色谱法建立同时测定彩泥中苯甲酸、苯甲醇、甲基异噻唑啉酮、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯等9种防腐剂含量的方法。为彩泥制品中防腐剂进行合理产品风险评估提供一种高效、可行的手段。

1 材料与试剂

1.1 材料

40组彩泥(造型黏土)购置于流通领域(网络平台)，价格5.5～79元/盒。

1.2 仪器及试剂

高效液相色谱仪：UltiMate 3000型(配二极管阵列检测器DAD)，美国Thermo Fisher公司；超纯水系统：Milli-Q Direct 16型，德国Merck公司；超声波提取仪：EMMI 60HC型，德国EMAG公司；高速冷冻离心机：3K15型，德国SIGMA公司；电子天平：ME204E/02型，瑞士METTLER TOLEDO公司；涡旋振荡器：Multi Reax型，德国Heidolph公司。

苯甲酸、苯甲醇、甲基异噻唑啉酮、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯9种防腐剂(纯度均≥98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)；实验室用超纯水(18.2MΩ·cm，25℃)、甲醇、乙腈(HPLC级，美国Thermo Fisher公司)、磷酸二氢钠(优级纯，成都市科龙化工试剂厂)。

2 实验方法

2.1 仪器条件

Kromasil 100-5C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；流速：1.5mL/min；进样量：5μL；流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠+甲醇+乙腈=50+35+15(体积比)；检测波长：甲基异噻唑啉酮为280nm检测，其余防腐剂在254nm检测。在色谱条件下，对标准品溶液进行分析，甲基异噻唑啉酮、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸异丁酯的色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于5000，拖尾因子均在0.95～1.05之间(图1、图2)。

图1 9种防腐剂的典型液相色谱图(检测波长：254nm)1.甲基异噻唑啉酮(1.617min)；2.苯甲醇(3.320min)；3.对羟基苯甲酸甲酯(4.550min)；4.苯甲酸(6.223min)；5.对羟基苯甲酸乙酯(7.463)；6.对羟基苯甲酸异丙酯(12.260min)；7.对羟基苯甲酸丙酯(13.967min)；8.对羟基苯甲酸异丁酯(25.740min)；9.对羟基苯甲酸异丁酯(27.773min)

图2 9种防腐剂的典型液相色谱图(检测波长：280nm)1.甲基异噻唑啉酮(1.617min)；2.苯甲醇(3.320min)；3.对羟基苯甲酸甲酯(4.550min)；4.苯甲酸(6.223min)；5.对羟基苯甲酸乙酯(7.463)；6.对羟基苯甲酸异丙酯(12.260min)；7.对羟基苯甲酸丙酯(13.967min)；8.对羟基苯甲酸异丁酯(25.740min)；9.对羟基苯甲酸异丁酯(27.773min)

2.2 标准溶液的配置

准确称取9种防腐剂标准品适量，用甲醇溶解后，转移至100mL容量瓶中，甲醇定容，制成混合标准储备液；取混合标准储备液适量，用甲醇制成混合标准系列1～5溶液，用高效液相色谱法进行检测，采用外标法定量。其中，苯甲酸、苯甲醇的标准系列质量浓度：50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、500mg/L，甲基异噻唑啉酮、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯的标准系列质量浓度：5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L。

2.3 样品处理方法

准确称量彩泥(造型黏土)试样(选取同一色)约1g(精确到0.1mg)置于比色管中，准确加入乙腈10mL，涡旋振荡5min后超声萃取20min，冷却至室温、离心10min，取上清液经0.45μm有机滤膜过滤，所得滤液供液相色谱分析，采用外标法定量。

3 结果与讨论

3.1 提取溶剂的选择

根据9种防腐剂的物理性能(溶解性)，分别考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、正己烷六种溶剂的提取效率。结果表明：甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷四种溶剂对彩泥中对羟基苯甲酸酯类的提取效率不高(低于80%)，且提取液易浑浊，不宜过滤，不易操作；甲醇、正己烷、乙腈对甲基异噻唑啉酮提取效率较好(高于90%)；乙醚由于沸点低，挥发性强，易燃、易爆，且产生大量有机废液。为了能同时检测9种防腐剂，选择干扰少、回收率高、选择性广的乙腈作为提取溶剂。

3.2 检测波长的选择

移取苯甲酸、苯甲醇、甲基异噻唑啉酮、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯9种防腐剂混合标准溶液(标准溶液系列3)，用甲醇作为参比，在波长200nm～400nm范围内进行紫外吸收扫描分析，分别考虑各组分性质、吸收强度和流动相干扰等因素，选择合适的检测波长。结果表明：甲基异噻唑啉酮选择在280nm检测(其中，254nm处，甲基异噻唑啉酮浓度10mg/L，峰面积0.530mAU*min，峰高10.511mAU；280nm处，甲基异噻唑啉酮浓度10mg/L，峰面积1.287mAU*min，峰高24.335mAU；因此，280nm处检测灵敏度高)，其余8种防腐剂选择在254nm检测，各组分能够得到较好的分离效果。其中，9种防腐剂标准图谱请见图1和图2。

3.3 标准曲线线性范围、相关系数、检出限及定量限

依据实验方法(2.1、2.2)，采用液相色谱仪分析混合标准系列溶液，平行测定3次，得到各组分质量浓度x(单位：mg/L)与峰面积y(单位：mAU*min)的线性回归方程与相关系数R2；根据信噪比(S/N)=3计算方法检出限，信噪比(S/N)=10计算方法定量限，结果见表1。结果表明，9种防腐剂在各自的质量浓度范围内线性关系良好(R2均大于0.998)。

表1 线性范围、线性方程、方法检出限与定量限

注：线性范围、检出限及定量限(取样量为1g，稀释体积10mL计)的单位为毫克每千克(mg/kg)

3.4 稳定性、回收率与精密度试验

在待测样品中加入低、中、高浓度(线性范围内)水平的混合标准溶液，利用液相色谱法，按照仪器条件(2.1)进行9种防腐剂含量的测试，考察方法的精密度与回收率；此外，分别在0h、2h、4h、6h、12h和24h测定9种防腐剂含量，考察样品的稳定性。结果(n=6)表明：9种防腐剂稳定性(RSD)均小于3%，样品溶液在24h内较为稳定；回收率在90.9%～106.9%之间，精密度(RSD)为0.89%～2.88%，方法适用于彩泥制品中苯甲酸等9种防腐剂含量的测定，具有简便、快速、灵敏度高等优点，结果见表2。

表2 9种防腐剂稳定性、加标回收率与精密度结果(n=6)

注：N.D即低于本方法检出限(下同)

3.5 样品分析

依据实验方法(2.1、2.2)，对40组网络平台购置的彩泥制品进行9种防腐剂的检测，为了便于分析比较，此次检测样品颜色统一(黑色彩泥)。结果表明：40组彩泥制品中，11组检出防腐剂(表3)，其余均未检出防腐剂；苯甲酸、苯甲醇、甲基异噻唑啉酮、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯均有检出，对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯和对羟基苯甲酸异丁酯均未检出；其中，欧盟标准EN 71-9:2005+A1:2007中甲基异噻唑啉酮限量为0.25mg/kg，5组彩泥制品含量高于限量，最大检出量为50.5mg/kg；对羟基苯甲酸甲酯最大检出量1559.5 mg/kg，苯甲酸最大检出量598.6mg/kg，苯甲酸最大检出量1697.2mg/kg，对羟基苯甲酸乙酯最大检出量109.5 mg/kg，对羟基苯甲酸丙酯最大检出量666.2mg/kg。

综上所述，在彩泥制品中，甲基异噻唑啉酮含量远远高于欧盟标准，应作为极其重点的风险监控对象；此外，苯甲酸、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯应作为重点风险监控对象，提前预防突发性安全事故的发生。

表3 样品检出结果 mg/kg

4 结 论

建立了一种同时检测彩泥制品中9种防腐剂含量(苯甲酸、苯甲醇、甲基异噻唑啉酮、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯和对羟基苯甲酸异丁酯)的超声萃取-高效液相色谱法，方法简便、快速、高效、灵敏度高，方法检出限为5mg/kg～200mg/kg，样品的加标回收率为90.9%～106.9%，精密度和稳定性的相对标准偏差分别为0.89%～2.88%、0.54%～2.58%，可适用于彩泥制品中防腐剂的检测。为彩泥制品中多种微量防腐剂含量进行合理产品风险评估提供一种高效、可行的手段。