基因治疗与遗传性耳聋

顾湘 郭维维 杨仕明

听觉作为人类最重要的感知觉之一，在人们的日常生活中具有不可替代的重要作用。耳聋，即听觉功能障碍，表现为不同程度的听力损失，影响了全世界约3.6亿的人口和1/500的新生儿[1]。据全国残疾人抽样调查统计数据显示，我国现有听力语言残疾者2780万，其中感音神经性聋占重度耳聋中的绝大部分[2]。在重度感音神经性聋患者中，超过60%是由于遗传因素引起，且这一比例在儿童患者中表现得更高。根据临床表现的不同，遗传性耳聋通常被分为非综合征型（70%）和综合征型（30%）两大类。其中，非综合征型遗传性耳聋是指临床上仅出现听觉功能障碍，不伴随其它器官和系统异常，其发病率为1/800～1/1000。目前，针对遗传性耳聋的治疗重点是通过各种听觉辅助设备放大声音，以恢复患者的听觉功能，但却不能接近自然听觉水平。因此，探索遗传性耳聋的生物治疗方法势在必行。

1 基因治疗相比其它生物治疗手段的优势

近年来，针对遗传性听力下降的治疗研究探索了很多生物治疗的方法，其中最热门的方法包括促进毛细胞再生、干细胞移植以及基因治疗。

众所周知，对于哺乳类动物来说，内耳毛细胞不可再生，一旦损失便没有办法补充，而鸟类和鱼类的毛细胞却可以在损伤后重新产生。基于这种差别，促进毛细胞再生的研究一直在进行中。目前认为，毛细胞的分化由Math1基因和转录因子ATOH1调节控制。但截至目前，针对成年的哺乳动物ATOH1调控的研究均未能产生足以恢复听力的毛细胞，且ATOH1的持续表达反而会引起大量的毛细胞凋亡[3]。解放军耳鼻咽喉研究所对听觉生理及聋病进行了长期系统研究，而且在毛细胞再生研究方面也已有相当的积累[4～6]。该课题组最新研究结果发现，经圆窗膜以重组腺病毒为载体成功将Math1基因导入爆震性聋豚鼠内耳[7]，发现基因转导1个月后部分豚鼠听力开始恢复，2个月听力有更好的改善[8]。

另外一个相对热门的方法是干细胞移植。将具有分化能力的干细胞引入听力受损的耳蜗中，通过适当的环境诱导，使其分化成为毛细胞。干细胞的来源包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞或从内耳提取的干细胞。目前用于研究的主要是胚胎干细胞和诱导多能干细胞。尽管在体内和体外均已成功通过诱导使干细胞分化成为毛细胞样细胞[9]，该研究目前的瓶颈是在干细胞移植后，分化出来的毛细胞并没有集中分布在Corti器，而是杂乱分布且成活率很低。

随着人类基因组计划及精准医学计划的实施，人们对遗传性聋的认识也在分子水平上得到突破。利用基因编辑的方法，通过对实验动物进行基因编辑获得基因缺陷动物，或对已有的基因缺陷动物进行基因纠正是现阶段探索遗传性病最为普遍和有效地研究方案。

人们尝试将具有相应功能的基因片段导入基因缺陷患者的细胞中。这一导入过程依赖于病毒基因转运载体。目前较常用的病毒基因转运载体有慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。慢病毒(lentivirus)载体是非常高效的转运载体，其靶向的细胞种类非常广泛，但在感染过程中会整合到宿主细胞染色体并表达自身蛋白引起免疫反应，因而不是最理想的病毒基因转运载体。腺病毒(adenovirus，ADV)载体是一种无包膜的线性双链DNA病毒，靶向范围广、致病性低、基因表达能力强，但由于ADV其中的一些血清型在人群中广泛传播，大约80%的健康成年人体内都含有一种或几种抗ADV不同血清型的抗体。这就造成部分血清型的ADV无法感染人体，限制了可改造的血清型别。初次感染ADV后病人会产生抗体，无法二次使用同种血清型的ADV进行治疗。腺相关病毒(adreno-associated virus，AAV)是一种小型的无包膜的二十面体病毒，经过改造的AAV载体并不会整合到宿主基因染色体上，并且AAV不同血清型别都有其特异性的靶器官，这使得AAV成为现阶段基因治疗相关研究的理想载体。

2 基因编辑技术

2.1 早期的基因编辑工具

锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）和Z F N s的升级版转录激活子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）是两种早期的基因组工程工具。这两种基因编辑技术对每个新的目标序列，都需要设计一个新的DNA长片段（500～1500碱基对）合成相应目的蛋白。此外，由于非特异性核酸内切酶FokI形成二聚体才有内切酶活性，故ZFNs和TALENs都需要合成两个新的蛋白，操作复杂，效率偏低，对实验设备要求较高，且都存在较为显著的脱靶问题，一直较难普及。

2.2 CRISPR/Cas9基因组编辑

CRISPR/Cas技术作为第三代的靶向基因组编辑技术系统，一问世就吸引了整个科学界。该技术的发现者珍妮弗和艾曼纽因此获得了“2015年度生命科学突破奖”。相较于前面两种基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术简便、易用，且成本低廉，具有可编程性以及可同时编辑多个基因，最重要的是针对人类细胞靶序列作用时具有很高的特异性（90%）和较低的脱靶率（20%）[10]。这些优势使得CRISPR/Cas基因组编辑技术被应用于多种真核和原核生物，其产生的研究成果涉及农业、畜牧业、生物、医学等各个领域[11]。

CRISPR/Cas基因最早是1987年在大肠杆菌基因组中首次发现的[12]。CRISPR/Cas系统被认定为细菌适应性免疫系统，由规律成簇间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和CRISPR相关（CRISPR-associated，Cas）两部分组成，该系统广泛存在于微生物界中。40%的细菌和90%的古生菌中都发现了CRISPR/Cas系统[13]。根据核酸内切酶的识别和切割机制的不同，CRISPR/Cas系统被分为I～Ⅵ型。目前作为靶向基因编辑工具，最广泛应用的是来源于化脓性链球菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统。该系统由Cas9蛋白、crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating crRNA）组成。在这个系统中，Case9蛋白具有核酸内切酶功能，tracrRNA参与crRNA的成熟过程，并与crRNA形成复合物，结合到入侵的噬菌体或质粒的互补双链DNA序列上，并引导Cas9核酸酶对外源DNA靶向切割，从而起到免疫保护作用[14]。随着研究的深入，研究人员用sgRNA代替了crRNA和tracrRNA对CRISPR/Cas9系统进行了简化。sgRNA由碱基互补配对区（base pairing region）、Cas9把手（Cas9 handle）和终止子（terminator）3部分组成，简化了和目标基因配对结合的过程。精心设计的gRNA能显著降低脱靶效应，从而获得较高的基因编辑有效率。另外，Cas9在定位结合目标序列时，只需识别与目标序列附近的前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM），而PAM序列普遍的存在基因组[15]，这就使得CRISPR/Cas9系统应用范围非常广泛。

切割形成D N A双链断裂（double-strand break，DSB）的修复途径共有两种：非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源性定性修复（homology directed repair，HDR）。研究发现，NHEJ途径进行修复时易发生碱基的插入或缺失，从而引发编码区的移码突变，准确性相对较低[16]。HDR途径属于精确修复途径，在修复过程中，需要提供同源的DNA模板。通过对DNA模板进行合理地设计，HDR途径可以准确的进行特定核苷酸序列的插入、敲除和替换，从而达到对目标DNA序列进行精确编辑的目的[17]。目前，活体动物模型中HDR的效果尚未可知，且HDR在活体动物中的效率很低(＜1%)，其内耳研究中的可行性仍需进一步研究证实。CRISPR/Cas9在听力学研究中应用的一个主要挑战是该技术对PAM序列的依赖，如果单核苷酸碱基替换突变序列周围没有PAM序列，此时基因编辑便可能受到限制。

此外，CRISPR/Cas9系统的最大优势在于它可以和AAV载体结合使用，2015年5月《nature》发表了美国的张峰实验室首次利用来自金黄色葡萄球菌的Sa Cas9构建腺相关病毒介导的CRISPR/Cas9系统的文章[18]，在高效率的同时获得了高靶向的优势。

3 基因编辑技术在遗传性聋研究中的应用

非综合征型耳聋作为一种单基因病，其传递方式符合孟德尔分离定律，包括常染色体显性遗传（22%）、常染色体隐性遗传（77%）、X-连锁遗传（1%）、Y-连锁遗传（仅在中国有一个家系报道）和线粒体突变母系遗传（＜1%）[19]。目前，已报道的非综合征型耳聋基因座位共175个，定位在全部的常染色体和两条性染色体及线粒体基因上，分别编码细胞骨架、转录因子、离子通道、转运蛋白等重要功能蛋白[20]。耳聋患者的基因突变也有很多种，包括单核苷酸替换、碱基缺失、插入等。治疗这些由于基因突变引起的听力下降的最理想的方案，是在基因水平选择性纠正这些变异。目前，针对遗传性聋的研究，多数仍停留在基因筛查，明确诊断以及遗传指导方面，对于基因突变的纠正仍然需要进一步研究，这就为基因编辑技术在遗传性聋的治疗方面提供了更为广阔的前景。

随着基因编辑技术的进步和推广，短短的几年时间内，研究人员利用基因编辑技术成功的构建了各种遗传性耳聋的动物模型。小鼠是研究人类遗传性耳聋的应用最为广泛的动物模型。2014年，Harms DW建立了基于CRISPR/Cas9构建小鼠模型的标准流程[21]。这些动物模型极大程度地推进了遗传性耳聋的疾病机理、临床表现和治疗探索等研究。目前相对前沿的几个突变基因包括Vglut3，Tmc1，WHRN，Ush1C，USH3A，Gjb2等，表1中分别对他们的研究现状进行了总结。

4 内耳的特点在基因治疗中的优势

耳聋的基因治疗之所以成为近年来研究的热点，除了临床应用中的实际需要外，还得益于内耳在结构上具有的独特优势。内耳是一个相对容易接触，却又封闭且充满液体的空间。它的天然屏障——血迷路屏障，可以使注入耳蜗的药物在靶器官内保持高浓度的同时最大限度地减少全身分布，降低了非靶向器官和组织的毒性，这一点已被研究证实[29]。因此，通过何种途径向内耳输送基因编辑工具需要进一步研究。目前在实验动物上已经探索了多种向内耳输送的方法，包括通过圆窗或卵圆窗注入外淋巴系统[29]；或通过耳蜗造孔注入前庭阶或鼓阶[30]；或通过半规管造孔术[31]注入中阶。这些途径都在不同程度上完成了药物向内耳的转运，然而由于内外淋巴钾离子浓度的差异，转运过程中血迷路屏障的破坏也存在两个潜在的问题。第一，高钾向外淋巴泄露可能导致基底转的毛细胞和神经细胞的凋亡。第二，对内、外淋巴液之间紧密连接的破坏可造成耳蜗电位80～120 mV的电位下降，进而引起毛细胞感知的驱动力的降低，直接导致听阈提高。因此，如何有效地保证导入效率的同时减少导入造成的副损伤仍是需要研究探讨的问题。从目前的研究结果来看，通过前庭系统导入，即耳蜗内淋巴相连通，又不存在内淋巴电位，可以有效地避免耳蜗电位下降的问题，相对来说具有一定优势[31]。

5 耳聋动物模型的选择

构建携带基因缺陷的动物模型是进行基因治疗研究的前提。鼠具有价格经济且繁殖迅速的优势，是应用在医学领域最为广泛的实验动物，在针对耳聋的基因纠正研究中应用也是最多的，前文总结的耳聋基因治疗的成功案例全部是以小鼠为研究模型。然而，鼠和人的进化关系远，在内耳形态、物质、能量代谢等基础生理特征方面差异大，且鼠类在听力发育上属于晚熟种类，其在出生后14天才获得听力；而人类在胚胎期5个月就已经获得听力。这些差异导致很多基因敲除的小鼠并不能完全模拟人类的疾病表型。如SLC26A4基因敲除的小鼠，尽管可以表现出前庭水管扩大的特点，但小鼠模型表现出的是先天性耳聋，不同于人类前庭水管扩大患者中相当比例表现出迟发性、波动性听力下降的特点，并且不出现甲状腺病理改变和功能异常，不能完全模拟人类Pendred综合征的表型[32]。此外，鼠类体型过小，内耳组织尤其微小，使得一些实验操作如内耳基因导入操作难度大，精度难以保证。

基于鼠模型的以上缺点，人们在耳聋的动物模型方面也进行了很多探索。灵长类动物因其和人类相近的进化关系首先进入了人们的视野。但应用其实验往往会涉及伦理问题，且繁殖速度较慢，难已得到纯的品系，因此未能大规模推广应用。近年来，猪用作耳聋研究的动物模型逐渐受到学者认可。首先猪是医学实验动物中除灵长类以外和人类进化关系最近的物种，且是大型医用动物模型中繁殖效率最高、发育周期最短、最经济易得的。猪被选作耳科疾病及听力学研究的基础动物模型绝非偶然。一方面，以往研究表明，尽管猪的颞骨在外耳道的长度和位置上与人类差异较大，但其中耳结构却与人类的中耳非常相似。另一方面，在听觉功能方面，早在1990年就有研究报道，野猪与人类具有相似的行为听觉范围和最佳听觉灵敏度。Hansen等人[33]在1992年针对高胆红素血症对新生仔猪(2～9天)听觉诱发电位波幅的影响的研究中清晰的记录到了新生猪仔的听觉脑干反应(ABR)和良好的I-V波，表明猪和人一样是听力早熟物种.当然，作为大型实验动物，猪在其成年后的体重可以超过100公斤，实验操作不够便捷。且选用猪进行动物实验，其购买、饲养、收容、分娩等方面成本也比小型动物昂贵得多，这些方面的缺点严重的限制了猪在实验研究中的应用。基于以上前提，身形和体重只有正常猪的1/5的小型猪便自然地受到了耳科及听力学学者们的关注。其成年体重在20～30公斤，身体大小约为50厘米长，20厘米高。小型猪耳蜗有三圈半，膜迷路总长度为39毫米，其颞骨解剖已被证实和人类的十分相似[34]。听阈范围也和人类非常接近，4 k～32 kHz的ABR的平均阈值为35～45 dB。因此，小型猪既拥有和人类非常接近的内耳结构和听力学功能，又不像普通猪那样体型庞大不方便操作，是目前耳科疾病和听力学研究的最为理想的实验动物。解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科杨仕明团队在国际上率先提出并证明了猪是耳科学研究领域的理想实验动物[35-39]。近年来，成功建立了多种遗传性状稳定的先天耳聋小型猪模，包括Mitf-M突变耳聋猪模型、Sox10突变内耳畸形聋猪模型以及Kit突变聋猪模型。采用这些遗传背景清楚、生物学特性明确的耳聋猪模型，将为进一步推进遗传性耳聋病因及治疗的研究提供有力的支持。

表1 前沿的耳聋突变基因研究现状

综上所述，内耳基因治疗具有恢复或防止听觉功能衰退的潜力，拓展了人类的聋病治疗思路。尽管目前针对耳聋尚无将动物模型中成功的基因治疗方法应用于人类的探索记录，但对于治疗其他疾病，全世界有超过1800个已完成，或正在进行的涉及基因治疗临床试验[40]，可以从这些更先进的基因治疗领域吸取经验教训。在不久的将来，耳聋的基因治疗会像人工耳蜗植入一样，成为遗传性聋的常规治疗手段之一被广泛应用于临床。