血府逐瘀汤干预肺纤维化大鼠作用机制研究

王 祺，于雪峰，齐 越，刘小虎

0 引言

肺间质纤维化是一种全球公认的难治的呼吸系统疾病，近年来其发病率和病死率呈上升趋势。本课题组应用活血化瘀代表方剂血府逐瘀汤加减治疗肺纤维化，临床观察多年，疗效较为满意。本实验采用血府逐瘀汤干预肺纤维化大鼠，通过观测肺纤维化大鼠肺系数、肺组织肺泡炎和肺纤维化程度以及Smad-3、基质金属蛋白酶(Matrix metalloprotinase,MMP)-7蛋白表达情况的变化，进一步探讨血府逐瘀汤干预肺纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选择体重180～220 g SPF级健康雄性 Wistar 大鼠60只，合格证号：SCXK(辽) 2015-0001。血府逐瘀汤的组成及剂量遵照《医林改错》，由辽宁中医药大学附属第二医院中药分析实验室制备。试剂、药物：注射用盐酸博莱霉素(海正辉瑞制药有限公司，批号：1603231);盐酸泼尼松片(5 mg/片，天津力生制药股份有限公司，批号：1707051)；苏木素染液(货号：BA-4041)、伊红染液(货号：BA-4024，水溶性)，粤珠食药监械；Masson三色染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：16032311)、Smad-3免疫组化试剂盒(北京博奥森生物有限公司，批号：bs-3484R-50)、MMP-7免疫组化试剂盒(北京博奥森生物有限公司，批号：bs-0423R)。

1.2 方法

1.2.1 肺纤维化大鼠模型建立 依据王飞等[1]方法造模，手术过程严格无菌操作，向空白组大鼠气管内注入等容量生理盐水。

1.2.2 分组及给药 60只大鼠饲养于辽宁省中医药研究院实验动物中心，适应环境后随机分为空白组(NS组)、模型组(BLM组)、泼尼松对照组(PC组)、血府逐瘀汤低剂量组(XL组)、血府逐瘀汤中剂量组(XM组)和血府逐瘀汤高剂量组(XH组)，共6组，每组大鼠10只。于造模第2天起，空白组、模型组每日1次灌服同等容积的生理盐水；泼尼松对照组每日灌服1次相当于 6.25 mg/kg 生药的盐酸泼尼松；血府逐瘀汤高、中、低治疗组每日灌服1次相应剂量的血府逐瘀汤，剂量分别为相当于 14.04 g生药/kg(20 ml/kg)、7.02 g生药/kg(10 ml/kg)、3.51 g生药/kg(5 ml/kg)。

1.2.3 标本采集及方法 各组于给药第14天称重后处死大鼠(每组6只)。每组大鼠分别应用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 ml/100 g)后活体取材，开胸将肺组织完整取出并分离,用滤纸将血液擦净，称取肺湿重，计算肺系数。

取右肺于预冷生理盐水中快速洗去血液，剔除结缔组织，放入10%福尔马林中固定,常规石蜡包埋,行HE染色、Masson染色、Smad-3和MMP-7免疫组化染色。

1.2.4 指标检测及判定标准 实验期间观察各组大鼠一般状况，计算肺系数[肺系数=肺湿重(g)/身体重量(kg)×100%]。病理切片行HE染色、Masson染色，依据 Szapiel 等[2]方法，于光镜下观察病理组织学变化，评价各组大鼠肺组织肺泡炎程度及肺纤维化程度；行Smad-3、MMP-7免疫组化染色，图片采用Image J软件进行阳性细胞计数分析，计算阳性细胞表达率(阳性细胞占比)，阳性细胞表达率越高，表示反应越强。

2 结果

2.1 大鼠一般状况 空白组大鼠状态良好，神态正常，身体活动灵活，呼吸平稳，毛色纯白，皮毛光滑润泽，摄食饮水好，体重逐渐增加。模型组大鼠可见精神萎靡，喜倦卧，呼吸急促，皮毛无光泽，摄食饮水明显减少，体重增加缓慢，明显低于同期各给药组大鼠。泼尼松对照组、血府逐瘀汤各治疗组大鼠状态较好，活动较灵活，呼吸平稳，皮毛光泽度较好，摄食饮水较好，体重较同期模型组增加明显。提示血府逐瘀汤各治疗组和泼尼松对照组大鼠的一般状况得到改善。

2.2 肉眼观察 空白组大鼠双肺无异常，呈粉红色，表面光滑、饱满，弹性好。模型组大鼠双肺呈暗红色，有点状出血点，体积缩小、弹性较差，部分肺叶呈灰白色，表面凹凸不平。各给药组与模型组病变接近，程度较模型组稍轻。

2.3 各组大鼠肺系数、肺泡炎、肺纤维化程度 ①大鼠给药第14天，空白组与模型组比较，肺系数、肺泡炎、肺纤维化均明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。②给药第14天，各给药组大鼠肺系数与模型组比较均有不同程度的下降；对照组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，血府逐瘀汤低、中、高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。血府逐瘀汤组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。③给药第14天，各组大鼠肺泡结构均有不同程度的破坏。各给药组与模型组比较，肺泡炎和肺纤维化程度均有不同程度的改善。肺泡炎评分：对照组、血府逐瘀汤高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；纤维化评分：对照组、血府逐瘀汤高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，血府逐瘀汤低、中剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。各给药组肺泡炎、纤维化评分与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1、图2。

表1 第14天血府逐瘀汤对大鼠肺系数、肺泡炎、肺纤维化的影响(n=6)

注：与BLM组比较，*P<0.05，**P<0.01

图1 第14天各组大鼠肺组织病理学改变(HE，40×)

图2 第14天各组大鼠肺组织病理学改变(Masson，40×)

2.4 各组大鼠Smad-3蛋白表达 给药第14天，与空白组比较，各组Smad-3蛋白表达均呈上升趋势，泼尼松对照组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)，模型组及血府逐瘀汤低、中、高剂量组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)。②与模型组比较，其余各组均有不同程度蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。③血府逐瘀汤各组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3。

2.5 各组大鼠MMP-7蛋白表达 ①与空白组比较，模型组及血府逐瘀汤中、高剂量组大鼠给药第14天 MMP-7蛋白表达显著升高(P<0.01)，对照组、血府逐瘀汤低剂量组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。②给药第14天，各给药组与模型组比较，均有不同程度的蛋白表达降低；对照组、血府逐瘀汤高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，血府逐瘀汤低、中剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。血府逐瘀汤各组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图4。

表2 第14天血府逐瘀汤对大鼠Smad-3、MMP-7蛋白表达的影响(n=6)

注：与BLM组比较，*P<0.05，**P<0.01；与NS比较，#P<0.05；##P<0.01

图3 第14天各组大鼠肺组织病理学改变(Smad-3，400×)

图4 第14天各组大鼠肺组织病理学改变(MMP-7，400×)

3 讨论

肺间质纤维化是全球公认的呼吸系统疾病中的难治病，是以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的一种疾病。

血府逐瘀汤为活血化瘀法代表方剂，出自清朝王清任编著的《医林改错》。血府逐瘀汤由桃仁、红花、川芎、赤芍、当归、生地、黄芪、丹参等药物组成[3]。其中丹参可以通过抑制肺纤维化大鼠TGF-β1/Smads信号途径发挥抗纤维化的作用[4]；川芎嗪可以通过减轻肺纤维化大鼠肺组织结构的氧化损伤达到防治肺纤维化的效果[5]；赤芍可以通过TGF-β1和Smad-3/4 信号传导通路发挥抗纤维化作用[6-7]；蔺兴遥等[8]通过观察黄芪黄酮与红芪黄酮对肺间质纤维化大鼠肺功能的影响，发现黄芪黄酮具有抑制大鼠肺间质纤维化的作用。血府逐瘀汤中包含有逆转心肌纤维化的有效药物和成分[9]；对肺纤维化模型动物的氧自由基损伤有不同程度的干预作用，并通过降低血清HA、肺组织HYP、胶原蛋白含量及提高弹性纤维含量改善其细胞外基质代谢[10]；可预防肺纤维化，缩小病变范围，改善患者生活质量，改善临床症状[11]等。

MMP是一类蛋白水解酶，主要功能为降解基底膜和细胞外基质(ECM)。MMP-7是MMPs家族中最小的成员之一，对于纤维连接蛋白、层黏连蛋白等细胞外基质均有较强的降解作用[12]。研究表明，肺纤维化的主要病理表现为ECM重塑。因此，当体内MMP-7的表达出现异常下降时，其对于ECM的降解作用亦大大减弱，使ECM出现异常增多，最终导致肺纤维化的发生发展。由此可知，增加体内MMP-7蛋白的表达，对于降解ECM，从而改善肺纤维化具有重要意义。

Smad-3位于细胞胞浆内，属于信号传导分子。病理状态下，活化后的受体与Smad-3结合，使其磷酸化后形成三聚体，随后作用于细胞核内的转录因子，促进EMT的生成和沉积，加速肺纤维化的形成。Sriram等[13]发现，Wistar大鼠经博来霉素诱导制成肺纤维化模型后，Smad-3的表达在促进ECM沉积、形成肺纤维化的过程中具有重要作用。另外，彭艳芳等[14]在应用肺纤维化大鼠进行试验时发现，降低大鼠体内Smad-3的过度表达，可减少大鼠体内ECM沉积，抑制肺纤维化进一步发展。

本研究表明，血府逐瘀汤可以降低肺纤维化大鼠肺系数、肺组织肺泡炎和肺纤维化程度，抑制Smad-3和MMP-7蛋白表达，但其与泼尼松对照组比较以及血府逐瘀汤各剂量组组间比较差异均无统计学意义，提示其可能通过抑制Smad-3和MMP-7蛋白表达来降低肺纤维化程度。