养肺解郁方对非小细胞肺癌伴抑郁小鼠的抗抑郁作用研究

余 达，邵莉莉，张凌燕，刘中良，田义洲

0 引言

非小细胞肺癌(NSCLC)是全球癌症相关死亡的主要原因之一，占所有肺癌病例的近80%[1]。尽管几十年来NSCLC的诊断和临床治疗取得了一定进展，但NSCLC患者的5年总生存率约为15%，复发率仍然很高[2]。肺癌的诊断和治疗通常会导致包括抑郁在内的负面情绪。抑郁症是一种精神疾病，其特征是普遍的低情绪和失去对正常活动的兴趣，并且是最常见的精神疾病，终身患病率为10%～20%[3]。研究表明，抑郁症在肿瘤患者中的发病率可达10%～30%，是正常人发病率的3～5倍[4]，严重影响NSCLC患者的生活质量，甚至降低治疗效果和生存率。此外，抑郁特别是重症抑郁可改变体内的激素水平，影响免疫功能，降低对肿瘤的免疫作用，从而间接影响肿瘤的发生、发展以及预后。养肺解郁方能够有效缓解NSCLC 患者的抑郁情绪，延长中位生存期和抑制抑郁可能导致的过早化疗耐药[5]。本研究观察了养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠的抑郁行为及其炎症反应的调节作用，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及动物来源 细胞株为具有高自发肺转移潜能的Lewis肺癌瘤株，移植100%，来源:国家实验细胞资源共享平台(China infrastructure of cell line resource)。实验动物为8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体重20～24 g，40只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验动物生产许可证编号:SCXK(沪)2017-0005。

1.2 药物、主要试剂及仪器

1.2.1 药物 养肺解郁方：南北沙参(各)12 g，黄芪15 g，防风6 g，浙贝母6 g，白术9 g，苍术9 g，薏苡仁15 g，石上柏15 g，全蝎3 g，郁金15 g，玫瑰花6 g，梅花6 g，合欢皮15 g，夜交藤30 g。恶心呕吐加凤凰衣6 g、竹茹9 g；腹泻加山药15 g、芡实9 g；便秘加望江南30 g、玄参15 g；热毒蕴肺加鸭跖草30 g、黄芩9 g；咳血加生蒲黄6 g、白茅根30 g、白芥子9 g、僵蚕6 g。所有中药饮片均由舟山中医院制剂中心按照国家药典标准提供。将混合物在100 ℃蒸馏水中煎煮2次，30 min，合并提取液，药物溶液按2个YFJY治疗组(YFJY-0.2 g生药/ml和YFJY-0.1 g生药/ml)进行浓缩，浓缩液灌胃给药，每只小鼠1 ml。

1.2.2 主要试剂与仪器 TNF-α、IL-6、BDNF酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。CREB、BDNF、NF-κB抗体购自美国Abcam 公司。小鼠旷场实验装置(30 cm×30 cm×30 cm)，莫里斯水迷宫装置(江苏赛昂斯生物科技有限公司)，Noldus ethovision XT装置(上海仁科生物科技有限公司)，酶标仪(Thermo FisherMK3型，上海赛默生物科技发展有限公司)。

1.3 分组、造模及给药 除对照组外，其余各组均采用CUMS法构建抑郁症模型。在21 d模型制作周期中，每天给小鼠1 种应激。应激方式包括：足底电击(2次/min，30 min)，强迫冷泳(4 ℃，5 min)、热应力(45 ℃，5 min)、水平振荡(30 min)、夹尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)和昼夜颠倒。应激原以随机顺序施加，同一应激方式不连续应用。除对照组小鼠外，模型组小鼠均在CUMS后于右腋下皮下接种1 × 107个LL/2细胞。CUMS + YFJY(10 g/kg，5 g/kg)组模型制作期间第1天开始分别灌胃相应浓度的YFJY，其余两组灌胃蒸馏水，3次/d。建模完成后，正常组小鼠每笼5只，接受CUMS小鼠单笼饲养，自由进食饲料与水，室温20～25 ℃，相对湿度60%～70%，光照周期12 h。种瘤第17日进行蔗糖偏好测试，第19日进行旷场测试，第21日进行强迫游泳实验。行为学实验结束后，摘眼球取血和断颈取海马组织进行后续实验，小心剥离皮下肿瘤组织并称重。每周进行小鼠体重和肿瘤体积测量和记录。

1.4 试验方法

1.4．1 蔗糖偏好试验 所有小鼠在12 h的食物和水分缺乏后单独关在笼子里(28 cm×17 cm×14.5 cm)。然后，给所有小鼠2瓶水或2%蔗糖溶液。蔗糖和水瓶被随机放置在笼子的两侧。6 h后，测量水和蔗糖的消耗量。根据蔗糖偏好度，计算大鼠对蔗糖的偏好，即2%蔗糖溶液(g)占总液体摄入量(g)的百分比 [蔗糖溶液/(蔗糖溶液+水)×100%]。

1.4.2 旷场试验 开场箱(30 cm×30 cm×30 cm)，分为25个等面积正方形。将小鼠放置场的中央区域。在5 min的观察期内，所有小鼠的运动都由连接到迷宫视频成像软件(Stoelting Co，Wood Dale，IL，USA)的计算机的摄像头记录下来。在对每只小鼠进行测试后，用75%乙醇清洁表面。记录小鼠经过的格数作为水平活动得分，前肢离体站立的次数作为垂直活动得分。

1.4.3 强迫游泳试验 通过将大鼠置于1个圆筒[60 cm(高)×25 cm(直径)]中，在24～25 ℃温度下水深30 cm进行FST。FST模型包括2个部分：最初的1 h预试验适应，随后进行4 min试验，统计小鼠不动的时间。当小鼠保持漂浮在水面，只有轻微的动作才能使头部保持在水面以上，停止挣扎，定义为不动时间。

1.4.4 ELISA 行为学实验 结束后，进行眼眶取血，然后断颈取海马组织，用RIPA 组织裂解液裂解，超声粉碎匀浆机匀浆，离心后取上清，根据说明书步骤用ELISA试剂盒检测血清中TNF-α、IL-6以及海马组织中BDNF的浓度。

1.4.5 Western blot 使用含PMSF的RIPA裂解液提取组织中总蛋白，冰上孵育30 min，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液。BCA试剂盒制样。上样，电泳后湿转法转膜2 h、封闭，滴加一抗(BDNF,CREB,p-CREB,NF-κB，p-NF-κB)，4 ℃孵育过夜后加入相应的二抗。随后滴加适量的ECL 显色液上机检测，最后用Image J 软件检测条带吸光度(A)值，以相应蛋白条带的灰度值/β-actin蛋白条带的灰度值表示相对蛋白含量。

2 结果

2.1 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠体重的影响 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠体重影响的周变化如图1 所示，对照组小鼠体重一直呈上升的趋势。模型组、YFJY-10 g/kg组和YFJY-5 g/kg组小鼠体重在前3周差异无统计学意义(P>0.05)。在随后的3周，YFJY-10 g/kg组和YFJY-5 g/kg组小鼠体重显著高于模型组(P<0.05)。养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠实验前后体重变化如图2所示，体重差值=第42天体重-第1天体重，与正常组相比，模型组小鼠体重增长相对缓慢(P<0.01)。与模型组比较，YFJY组小鼠体重增长较快，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠体重的影响

图2 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠实验前后体重变化的影响

2.2 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠行为的影响 在蔗糖偏好试验、旷场试验和强迫游泳试验中，与对照组比较，模型组小鼠蔗糖水偏好度、水平运动得分、垂直运动得分显著降低，游泳不动时间显著增加(P<0.01)，即小鼠出现明显的抑郁行为，表明小鼠CUMS模型构建成功。与模型组小鼠相比，YFJY-10 g/kg组和YFJY-5 g/kg组小鼠水平运动得分、垂直运动得分明显增加(P<0.05)，游泳不动时间缩短(P<0.05)，说明养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠的抑郁行为有显著改善作用。见图3～图5。

图3 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠蔗糖偏好度的影响

图4 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠旷场试验的影响

2.3 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠血清TNF-α、IL-6和海马组织中BDNF表达的影响 与对照组比较，模型组小鼠血清TNF-α 和IL-6 含量显著增加，海马组织中的BDNF含量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，YFJY-10 g/kg组和YFJY-5 g/kg组小鼠血清和海马组织中TNF-α 和IL-6 含量显著减少，海马组织中BDNF表达显著增加(P<0.05)，见图6～图8。

图5 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠游泳不动时间的影响

图6 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠血清中TNF-α的影响

图7 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠血清中IL-6的影响

图8 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠海马组织中BDNF的影响

2.4 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠NF-κB/CREB/BDNF信号通路的影响 如图9所示，与对照组比较，模型组小鼠海马组织中BDNF蛋白表达和CREB的磷酸化显著减少，海马组织中NF-κB的磷酸化明显增加(P<0.01)；与模型组比较，YFJY-10 g/kg组和YFJY-5 g/kg组小鼠海马组织中BDNF蛋白表达和CREB磷酸化显著增加，海马组织中NF-κB磷酸化明显减少。

2.5 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠皮下肿瘤重量和体积的影响 与模型组相比，YFJY组皮下肿瘤重量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图10。随着时间的增加，3组小鼠肿瘤体积均有所增加，其中YFJY-10 g/kg组和YFJY-5 g/kg组皮下肿瘤重量增加速度显著低于模型组(P<0.05)。

3 讨论

抑郁症是一种复杂的精神疾病，世界卫生组织通报全球超过3亿人患有抑郁症，导致严重的健康问题[6]。流行病学研究表明，抑郁与癌症死亡率有关[7]，因此，研究抑郁症与肿瘤进展相关的生物学途径和确切机制，对于癌症患者的治疗可能有重要作用。在实验室动物中，CUMS经常被用来模拟不可预知的生活压力，这些压力源可能会导致人类出现严重的抑郁症。本研究中，大鼠在CUMS后表现出典型的快感缺失行为，活动探索能力减弱和绝望行为，表现为蔗糖偏好试验中蔗糖偏好度降低，旷场试验中水平运动得分和垂直运动得分降低，强迫游泳试验中不动时间增加，表明抑郁大鼠模型建立成功。养肺解郁方可显著逆转上述变化，对NSCLC伴抑郁小鼠的抑郁行为起到干预作用。

鉴于炎症可能在抑郁症中起作用，抗炎剂可能是一种有用的抗抑郁药物或传统疗法的佐剂。养肺解郁方中的成分如鸡血藤、黄芪等，能够下调炎症诱导的生物标志物，包括促炎介质(IL-1β，IL-6，TNF-α)，上调抗炎蛋白(IL-10)的表达，并抑制NF-κB的激活[8-9]。作为一种诱导细胞因子表达并调节炎症级联反应的转录因子，NF-κB在应激期间增加海马和额叶皮质中的IL-1β和TNF-α表达，并且在海马中调节神经发生，与抑郁症密切相关[10]。养肺解郁方显著逆转模型小鼠血清中IL-6和TNF-α浓度的增加,抑制了NF-κB炎症信号。因此，养肺解郁方的抗抑郁活性可能与NF-κB介导的抗炎作用机制有关。

尽管目前应激反应中涉及的分子和机制尚不明确，但越来越多的证据表明，BDNF降低是抑郁症的关键病理生理学标志[11]。BDNF是脑中最普遍的神经营养因子，参与神经元的增殖、发育、分化和成熟[12]。BDNF通过CREB介导的过自身磷酸化机制增加自身的转录并负责神经元的存活、维持和生长[13]。抑郁症患者的血清、血浆和海马BDNF水平降低，血清BDNF水平降低可能是提示抑郁发生的指标[14]。另一方面，一些抑郁症的动物模型也显示脑区域中BDNF的表达减少[15]。最近的研究表明，NF-κB信号通路可以抑制CREB蛋白的磷酸化和BDNF的表达[16-17]。本研究结果显示，养肺解郁方治疗可以逆转模型组小鼠血清中BDNF水平的降低，增加模型组小鼠海马组织中CREB的磷酸化和BDNF蛋白的表达。考虑到BDNF与NF-κB通路的关系，推测养肺解郁方导致BDNF表达上调可能是由于其对NF-κB通路的影响。

图9 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠NF-κB/CREB/BDNF信号通路的影响

注：A.Western blot检测蛋白表达水平，B.BDNF/β-actin 的定量分析，C.p-CREB /CREB的定量分析，D.p-NF-κB/NF-κB的定量分析。

与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

图10 养肺解郁方对NSCLC伴抑郁小鼠皮下肿瘤质量和体积的影响

NF-κB可以促进肿瘤细胞增殖、存活、转移、炎症、侵袭、血管生成和对化疗和放疗的抗性，在肺癌中通常存在NF-κB的异常激活[18]。鉴于NF-κB 可能作为同时激活抑郁与肿瘤的信号，以及近来的文献研究结果显示，养肺解郁方可以通过缓解抑郁来减轻抑郁状态对晚期NSCLC中位无疾病进展生存时间的影响，延缓抑郁可能导致的过早化疗耐药[5,19]。因此，养肺解郁方可能通过调节NF-κB信号对肿瘤产生作用。本实验发现，养肺解郁方能够明显减缓NSCLC伴抑郁小鼠皮下肿瘤的生长，表现为肿瘤体积和重量显著低于模型组，进一步佐证了养肺解郁方缓解抑郁并减缓NSCLC进展的作用。

综上所述，养肺解郁方可以明显改善NSCLC伴抑郁小鼠的抑郁行为和相关指标，减少炎症因子水平，抑制皮下肿瘤的生长，其机制可能是抑制NF-κB介导的炎症信号，并促进CREB/BDNF信号级联。因此，本研究可能为NSCLC伴抑郁症的临床治疗提供一定的参考依据。