基于PCR检测的4种土传病害病原菌侵染棉花的动态分析

2019-08-15许泰百萨吉达木艾则孜李玉华郭庆元

新疆农业科学 2019年5期

许泰百，萨吉达木·艾则孜，吴琼，李玉华，李进，郭庆元

( 1.新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引言

【研究意义】2017年，新疆棉花播种面积达到2 217.47×103，占全疆农作物总播种面积的36.58%，产量达到456.60×104t[1]。长年连作导致棉花多种病害严重发生，新疆棉区也成为全国棉花土传病害发生最严重的区域之一[2]。新疆棉花病害主要包括立枯病、红腐病、枯萎病和黄萎病四种土传病害,以及部分地区零星发生的细菌性角斑病以及炭疽病两种茎叶部侵染病害。其中以四种土传侵染病害危害较重，常造成烂种、烂芽、烂根和茎基部腐烂，进而导致死苗，造成缺苗断垄，降低单产。近年来，立枯病发生普遍，红腐病开始日趋严重，黄萎病已经成为棉花生产中最重要的病害，枯萎病发生普遍，但因品种抗性使其严重度得到一定控制[3]。了解这几种病害的发生和流行动态，建立高效实用的防控技术及防控体系，提高对于这几种病害的防控水平具有重要意义。【前人研究进展】针对上述四种棉花病害及其病原菌早有研究，也有许多报道，但多集中在棉花某一种病害的病原、特点、发病条件、检测手段及防治方法方面的研究；也偶有对两种病害田间发生动态的调查。荆宝健[3]研究控制新疆棉花苗期病害的有效途径，王芙蓉等[4]分析了棉花根际真菌群落结构及其动态变化，李国英[5]描述了枯萎病和黄萎病田间发生流行和人工接种发病的时间动态。姜玉英等[6]总结了1991至2017年新疆病虫害演变动态，指出新疆发生为害加重、苗期病害和黄萎病尤为突出。自九十年代起，有设计出上述四种病害的特异性引物，建立了分别针对这几种病害检测技术，并应用于这些病害的调查和监测。【本研究切入点】传统的动态分析主要基于发病情况调查及病原菌分离结果，但基于分子检测的多病原侵染动态研究报道较少。研究利用已报道的棉花四种主要病原菌的特异性引物及其检测体系，对人工接种后分期采集的单株病样进行特异性引物PCR检测。【拟解决的关键问题】通过各时期病株检测结果，分析四种病原菌准确的侵染时间及对各自在棉株内的消长动态。通过人工接种实验，对不同时期的棉苗进行PCR检测，通过动态分析确定最佳防治时期，为病害高效防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

选取新疆棉花病样中已分离纯化并经致病力测定后确定的4种病原菌各3个菌株，总计12个菌株：分别是立枯丝核菌3个菌株(菌株号：RBHS15-112、RAKP15-211、RJHBBT)、尖孢镰孢霉3个菌株(菌株号：FKBC15-112、Fksf15-212、FAKS15-112)、串珠镰孢霉3个菌株(菌株号：FBYL15-111、FKYPH15-111、FKYC15-111)、大丽轮枝菌3个菌株(菌株号：VBV811-41、V991、VLT7-4)，所有菌株均由新疆农业大学农学院作物病害实验室分离、鉴定并提供。用作分子检测体系的建立及检测过程中的阳性对照。以及病原分离中常出现的非致病菌株：链格孢霉(菌株号：An11-23、An11-45)、茄腐镰孢霉(菌株号：FS12-93)、黑曲霉(菌株号：Aa15-8)、匍枝根霉(菌株号：RN12-95)，由新疆农业大学植物病理实验室分离、鉴定并提供，用于引物特异性检测。

1.1.2 设备与试剂

(650×260×210)mm的盆钵45个、离心管、蒸馏水、PCR扩增仪(VERITI 2.0)、高速冷冻离心机(AIIegra 25R)、组织研磨仪(Schwing mühle TissueLyser 2)、电泳仪(DYCP-31DN)、凝胶成像系统(G:BOXEF)、紫外透射仪(WD-9403C)、植物基因组DNA提取试剂盒(EE111-02)、2×TaqPCR Master mix、ddH20等。

1.1.3 供试培养基

供试培养基为PDA斜面培养基和平板培养基，用于各菌株的保存和扩繁。

1.1.4 供试麦粒菌种

选取健康饱满的麦粒，将麦粒浸泡12 h左右后冲洗干净，装入200 mL三角瓶中，加入少量葡萄糖溶液，封口后放入灭菌锅中，高温灭菌1 h。放置至常温后分别接入各菌株的病原菌，25℃培养7～12 d(大丽轮枝菌12 d，其他病原菌7 d)后备用。

1.2 方法

1.2.1 接种及调查

小区试验棉花品种为新陆早46号，将各病原菌3个菌株的麦粒菌种按种别等比混合成4种病原菌的接种用菌；与无菌土等比混合成4种病原菌混合菌土(菌土比4×0.25%)，搅拌均匀后，分装于育苗钵内，然后在菌土中播入棉种，以不接菌的灭菌土为对照。播种时间为2018年5月5日，试验地点在作物病害实验室内。

1.2.2 样品采集

自2018年5月15日出苗后起，每5 d，按整行采取棉株，每次采集15株，共采集12次，直到蕾铃期(共采样180株)，棉株采集后，经冲洗，分单株剪取根茎部组织(如有病痕尽量剪取病变组织)于锥型离心管(φ=1.5 mL)中备用。用于致病菌动态检测的样品分为五个时期即子叶期、一叶期、三叶期、六叶期、蕾铃期。

1.2.3 检测体系的建立1.2.3.1 病原菌DNA 提取

将菌株接种于PDA平板培养基上，27℃恒温培养7～12 d后，刮取菌丝约0.3 g放入锥形离心管(φ=1.5 mL)中，40℃下烘12 h，置于研钵中，加液氮研磨，然后按李焕宇改良后CTAB法进行菌株DNA的提取[7]。

1.2.3.2 特异性引物的筛选

通过文献收集供试引物，并经引物特异验证后优选的四种主要病原菌的四对特异性引物[8-12]，分别为：刘萍花等[13]2015年设计的立枯丝核菌特异性引物RSF/RSR，K. A. Abd-Elsalam等2006年设计的尖孢镰孢霉特异性引物Fov1-Eg-f/ Fov1-Eg-r[14]，庞莉2005年设计的大丽轮枝菌特异性引物VDS-F/VDS-R[15]和Murillo I1998年设计的拟轮枝镰孢霉特异性引物FUS1/FUS2[16]。四种引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成、提供。表1

表1 经验证后的四种病原菌特异性引物
Table 1 Confirmed specific primers for four species of pathogens

引物名称Primer引物序列(5'-3')DNA sequence of primer检测对象Detection object片段大小Fragment size /bp退火温度TM/℃来源sOurceRSFGCACACTCTTCTCTTTCATCCA立枯丝核菌RSRTTAGAAGCGGTTCGTCTGCAR. solaniFov1-Eg-f CCACTGTGAGTACTCTCCTCG尖孢镰孢霉Fov1-Eg-r CCCAGGCGTACTTGAAGGAACF. oxysporumFUS1CTTGGTCATGGGCCAGTCAAGAC拟轮枝镰孢霉FUS2CACAGTCACATAGCATTGCTAGCCF. verticilliodesVDS-FCACATTCAGTTCAGGAGACG大丽轮枝菌VDS-RCCGAAATACTCCAGTAGAAGGV. dahliae54159438621 6006052056上海生工生物工程技术有限公司

1.2.3.3 样品总DNA 提取及检测

将剪碎的样株组织置于1.5 mL离心管中，加入2个钢株(ø=3.0 mm)，经组织研磨仪研磨28/s，2～3 min研磨后，参照植物总DNA 提取试剂盒(EE111-02)上的操作说明进行样品DNA的提取。

1.3 数据处理

利用建立的检测体系和4对特异性引物，逐一加入各对引物对每个单株样品DNA进行PCR扩增、电泳，记录每一单株样品与4对特异性引物的反应结果。统计各病原菌在样株中的阳性检出率，以及两种以上病原菌的各种组合在单一病株中混合侵染的检出株率。

2 结果与分析

2.1 PCR反应体系的验证及检测体系的建立

用4对特异性引物分别对四种病原菌DNA和部分病株DNA样品进行的PCR检测试验，研究表明，RSF/RSR、FUS1/FUS2、VDS-F/VDS-R和Fov1-Egf / Fov1-Egr这4对引物仅在4种病原菌(立枯丝核菌(R.solani)、拟轮枝镰孢霉(F.verticilliodes)、大丽轮枝菌(V.dahliae)和尖孢镰孢霉(F.oxysporum))DNA样品中分别扩增出约541 bp、1 600 bp、520 bp和438 bp特异性片段；对4种病原菌的混合菌的PCR中也均扩增出与所用引物相对应的特异性片段；而阴性对照及其它非病原菌菌株和健康植株样品均无任何扩增产物，经分析其检测灵敏度小于0.5 ng/μL。

该反应体系下这4对引物对四种病原菌分别具有较强的特异性，且不受寄主DNA的干扰，能够从病株中检测到与感染菌相应的特异性条带，该体系可以作为田间病株的检测体系。图1、表2、表3

表2 PCR反应体系
Table 2 PCR reaction system

25 μL反应体系5 μL reaction system(μL)2x tap PCR Mastermix13ddH2O910 μmol/L上游引物Upstream primers 10 μmol/L110 μmol/L下游引物 Downstream primers10 μmol/L1植株总DNA Total plant DNA 1

表3 四种特异性引物的PCR反应程序
Table 3 Four kinds of primer PCR reaction program

步骤 step温度(℃)TM/℃时间Time循环数Cycle number预变性Pre-denaturation953 min变性Denaturation9445 s退火AnnealingFov1-Egf/Fov1-Egr621 minVDS-F/VDS-R5650 sRSF/RSR5945 sFUS1/FUS26045 s32延伸 Extension721 min再延伸Final extension7210 min保存 Keep4

A：引物FUS1/FUS2的特异性检测；B：引物Fov1-Egf/ Fov1-Egr的特异性检测；C：引物VDS-F/VDS-R的特异性检测；D：引物RsF/RsR的特异性检测；M：2 000 bpLadder maker；1～9：拟轮枝链孢霉(F.verticilliodes)、尖孢镰孢霉(F.oxysporum)、大丽轮枝菌(V.dahliae)、立枯丝核菌(R.solani)、链格孢霉(A. Nees)、茄腐镰孢霉(F.solani)、黑曲霉(A.niger)、匍枝根霉(R. stolonifer)、混合样品；CK：健康植株的基因(阴性对照)

A: The specificity detection of primers FUS1/FUS2; B: The specificity detection of primers Fov1-Egf/ Fov1-Egr; C:The specificity detection of primers VDS-F/VDS-R; D: The specificity detection of primers RsF/RsR; M:2,000D ladder Maker; 1-9: Fusarium verticilliodes held、Fusarium oxysporum f.p. vasinfectum(At K)Snyd et Hans)、Verticillium dahliae Kleb.、Rhizoctonia solani Kuh.、Alternaria Nees、Fusariumsolani、Aspergillusniger、Rhizopusstolonifer、Mixed sample; CK: Health tissue of maize(negative control).

图1 四对引物检对4种病原菌的特异性反应
Fig.1 Specific response of four pairs of primers to four pathogens

2.2 人工接菌后病原菌侵染动态

研究表明，四种病原菌在人工接种条件下，从子叶期到蕾铃期均能侵染棉苗；4种病原菌侵染动态相比较，立枯丝核菌侵染相对较早、较快，播种后10 d 即有26.7%的检出株率；拟轮枝镰孢霉次之，播种后 10 d即有13.3%的检出株率；立枯丝核菌、拟轮枝镰孢霉两种病原菌的侵染动态均表现出前期检出株率渐增，一叶期末到三叶期达到高峰，并以此为转折，以后检出株率降低，以幼苗期侵染为主要特点；而尖孢镰孢霉和大丽轮枝菌，虽从子叶期开始即可能侵染，但在子叶期至一叶期侵染株率较低(尖孢镰孢霉在播种后10～25 d 有6.7%～20%的检出株率，大丽轮枝菌在播种后15～25 d 有6.7%～13.3%的检出株率)，但从子叶期到蕾铃期两种病原菌的侵染株率呈渐增趋势，到蕾铃期趋于平缓，以整个生育期均可侵染为害为特点。

在四种病原菌等量接菌条件下立枯丝核菌侵染最快，早期侵染率最高，拟轮枝镰孢霉次之；立枯丝核菌、拟轮枝镰孢霉和尖孢镰孢霉的初侵染期相对较早，在播种后10 d 即可侵染，大丽轮枝菌的始侵染期稍晚，在播种后15 d；作为苗期病害病原菌的立枯丝核菌和拟轮枝镰孢霉之间，从子叶期到蕾铃期的各生育期中，立枯丝核菌的侵染株率总体上高于拟轮枝镰孢霉；作为维管束病害病原菌的尖孢镰孢霉和大丽轮枝菌之间，从子叶期到六叶初期，尖孢镰孢霉的侵染株率始终高于大丽轮枝菌，而六叶期到蕾铃期大丽轮枝菌的侵染株率高于尖孢镰孢霉。图2

图2 混合接种后四种病原菌在棉株中的消长动态
Fig. 2 Dynamics of growth and decline of four pathogens in cotton plants after mixed inoculation

2.3 四种病原菌间的混合侵染

对人工接种后动态采样及各样品检测结果统计分析可知，未检测到病原菌侵染的植株占总检测株数的28.33%；受到单一病原菌和多种病原菌侵染的检出株率为71.67%，其中，两菌混合侵染的检出株率为31.67%，3菌混合侵染的检出株率为11.67%；4菌混合侵染的检出株率为0；两菌及两菌以上混合侵染的检出株率为43.33%。说明混合侵染普遍存在，以两菌混合侵染比例较高。表4，图4

图3 基于子叶期到蕾铃期不同病原菌组合总检出率的单一侵染与混合侵染对比
Fig.3 Comparison of single infection and mixed infection based on total detected rate of different pathogen combinations from cotyledon stage to bell stage

对不同生育期不同菌种组合的混合侵染检出株率进行统计的结果显示,混合侵染比率与总的检出率及病害高峰期呈正相关，各病原菌的检出率低时，其混合侵染的比率也低，如子叶期和一叶期；各病原菌检出率高时，其混合侵染的比率也较高，如三叶期；4种病原菌的组合中，立枯丝核菌和拟轮枝镰孢霉、立枯丝核菌和尖孢镰孢霉，尖孢镰孢霉和大丽轮枝菌，以及立枯丝核菌和拟轮枝镰孢霉和尖孢镰孢霉等组合在各单株样品中有相对较高的检出株率，这些菌种之间较易形成混合侵染。表4

表4 各生育期棉株中不同病原菌组合的检出株率
Table 4 The detected rate of different pathogens combinations in cotton plants at various growth stages

病原菌种类Pathogen species不同生育期检出率Detected rate at different growth stages(%)子叶期*Cotyledon stage一叶期*One-leaf stage三叶期*Three-leaf stage六叶期**Six-leaf stage蕾铃期**Bell stage总检出率***The total detected rate(%)Rs10.00 16.67 13.33 8.89 2.22 9.44 Fv6.67 10.00 20.00 4.44 0.00 7.22 Fo0.00 0.00 3.33 6.67 6.67 3.89 Vd0.00 0.00 0.00 11.11 20.00 7.78 单菌检出率16.67 26.67 36.67 31.11 28.89 28.33 Rs+Fv6.67 10.00 10.00 4.44 4.44 6.67 Rs+Fo6.67 3.33 6.67 8.89 6.67 6.67 Rs+Vd3.33 6.67 6.67 4.44 4.44 5.00 Fv+Fo0.00 6.67 3.33 4.44 4.44 3.39 Fv+Vd0.00 0.00 10.00 6.67 2.22 3.89 Fo+Vd0.00 0.00 3.33 8.89 11.11 5.56 两菌检出率16.67 26.67 40.00 37.78 33.33 31.67 Rs+Fv+Fo3.33 6.67 10.00 2.22 4.44 5.00 Rs+Fo+Vd0.00 3.33 3.33 4.44 2.22 2.87 Rs+Fv+Vd0.00 3.33 3.33 2.22 2.22 2.22 Fv+Fo+Vd0.00 0.00 0.00 4.44 2.22 1.76 三菌检出率3.33 13.33 16.67 13.33 11.11 11.67 Fo+Fv+Rs+Vd0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

注：Rs：立枯丝核菌；Fv：拟轮枝镰孢霉；Fo：尖孢镰孢霉；Vd：大丽轮枝菌；*：子叶期、一叶期、三叶期各期采样2次，各期检测30株；**：六叶期至蕾铃期各期采样3次，各期检测45株；***：各生育期合计180个单株样品中的检出率

Note: Rs:R.solani; Fv:F.verticilliodes; Fo:F.oxysporum; Vd :V.dahliae;*：The cotyledonary stage, one-leaf stage, and three-leaf stage were sampled twice, and 30 strains were tested in each stage;**：The six-leaf stage to the bell stage were sampled three times, and 45 strains were tested in each stage;***：The detected rate of 180 individual samples in total growth period

3 讨论

3.1 在4种病原菌混合接种条件下，立枯丝核菌、拟轮枝镰孢霉、尖孢镰孢霉和大丽轮枝菌从子叶期到蕾铃期均能侵染棉苗；4种病原菌中立枯丝核菌侵染相对较早、较快；拟轮枝镰孢霉次之；立枯丝核菌、拟轮枝镰孢霉两种病原菌的侵染动态曲线均呈单峰形式，一叶期末到三叶期为侵染高峰，前期侵染株率从低到高渐增，后期从高到低渐减，以幼苗期侵染为主要特点；而尖孢镰孢霉和大丽轮枝菌两种病原菌从子叶期到蕾铃期的侵染株率呈渐增趋势，到蕾铃期趋于平缓，以整个生育期均可侵染为害为特点。

3.2 在4种病原菌等量接菌条件下立枯丝核菌侵染最快，早期侵染率最高，拟轮枝镰孢霉次之；立枯丝核菌、拟轮枝镰孢霉和尖孢镰孢霉的始侵染期相对较早，大丽轮枝菌的始侵染期稍晚；从子叶期到蕾铃期立枯丝核菌的侵染株率总体上高于拟轮枝镰孢霉；从子叶期到六叶期，尖孢镰孢霉的侵染株率高于大丽轮枝菌，而六叶期到蕾铃期大丽轮枝菌的侵染株率高于尖孢镰孢霉。

4种病原菌中，两菌及两菌以上的混合侵染普遍存在，以两菌混合侵染比例较高。混合侵染比率与总的检出率及病害高峰期呈正相关；4种病原菌之间，立枯丝核菌和拟轮枝镰孢霉、立枯丝核菌和尖孢镰孢霉，尖孢镰孢霉和大丽轮枝菌，以及立枯丝核菌和拟轮枝镰孢霉和尖孢镰孢霉较易形成混合侵染。

3.3 棉花土传病害的主要病害种类较多，其中以立枯病、红腐病、枯萎病、黄萎病为害较为严重。这4种病害均侵染根和根茎部，有的症状明显易区别，有的症状隐蔽不易区别；立枯病和红腐病属苗期病害，枯萎病和黄萎病属维管束病害，各自的侵染动态有一定的差异。而准确把握病害发生动态是选择最佳防治时期的关键。传统的田间发生动态调查，主要基于病害症状的识别或分离鉴定结果，容易出现一些判断上的误差，特别是对于可能产生多病原混合侵染的情况，较难准确判断病株中的病原种类和进行混合侵染分析。研究采用分子检测方法，可较为准的检测到成功侵入并有一定增殖量的多种病原菌，对于提高调查的准确性，特别是在多病原混合侵染分析方面有较大的优势，但也在一定程度上受到灵敏度的影响，可能出现一些病原菌侵入时间短，增殖量较少或取样偏离病点而漏检的情况。

研究结果中，尖孢镰孢霉和大丽轮枝菌引起的这两种病害检出率呈逐渐上升的变化趋势。这一趋势与李国英[5]基于病情指数变化的田间棉花枯萎病和黄萎病发生和流行动态分析结果基本一致，但在峰值出现时间和峰值出现次数上有一些差异，主要原因是研究在室内进行，温度相对稳定，调查期只有60 d，受变温影响较小。此外，研究中采用了4种病原菌等量混合接种，其接种压力较田间自然接种压力大，能反映用4种病原菌同时存在并相互影响的情况下，各病原菌的侵染动态及混合侵染情况，虽然与田间自然接种情况有些差异，但能在一定程度上反应出病原菌之间的影响，为进一步的病害与病害间的关系研究奠定基础。