一种腐熟菌剂对粪肥腐熟过程中菌群结构及其肥效的影响

陈 竞，谢玉清，代金平，古丽·艾合买提，张慧涛，

王志方，杨新平，秦新政，王小武，冯 蕾

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室， 乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】粪肥腐熟是在一系列微生物作用下，将其降解转化为稳定的腐殖质的生物化学过程[1]。腐熟过程中微生物的种类和数量与腐熟周期以及腐熟产品的质量都息息相关[2]，添加功能菌剂不仅可以改善功能微生物菌群数量和结构，同时可以加快堆肥反应进程，提高堆料分解率[3-4]。所以，分析评价粪肥腐熟过程中的菌群结构和数量及其肥效，对功能菌剂的添加和腐熟工艺的控制具有重要的指导意义。【前人研究进展】李杰等[5-8]的]研究表明,添加外源菌剂可使牛粪腐熟提前5 d达到最高温度，同时堆料pH值降低，总有机碳降解速度加快，种子发芽指数提前20 d符合堆肥标准( GI>80%)。李敬波等[9-10]研究发现，添加腐熟菌剂可使牛粪便堆肥细菌数量和放线菌数量提高，而真菌数量则降低，微生物总数提高。已有的研究结果充分证明功能菌剂与粪肥腐熟过程中菌群变化和有机肥的品质紧密相关。【本研究切入点】目前，将高通量测序技术结合荧光定量PCR技术应用于有机肥的研究较少。基于功能菌剂的添加影响粪肥腐熟的菌群结构和数量以及品质，研究利用不同来源的粪肥配方进行发酵处理，应用高通量测序技术和荧光定量PCR技术快速、灵敏、准确、特异性强和重复性好的优点[11-14]。对腐熟过程中微生物群落变化进行动态研究。【拟解决的关键问题】研究不同配方粪肥腐熟微生物群落的结构和丰度变化规律,分析品质和肥效，为功能菌剂添加和腐熟工艺优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

牛粪、羊粪、鸡粪取自新疆农业科学院安宁渠养殖场，自然晾干，分别称取1 kg混匀备用。菌剂为自筛菌剂，活菌数为109cfu/mL，主要由酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)及布氏乳杆菌(Lactobacillusparabuchneri)复配而成，菌剂添加量为1‰。配料为添加1%麸皮，物料和菌剂拌匀后装于塑料袋中，室温下(25～30℃)半密封发酵30 d，其中NA、YA、JA、为牛粪、羊粪、鸡粪各处理腐熟后样本，N5为牛粪对照组(不加菌剂)，NAP、YAP、JAP、N5P、为样品在穴盘完成番茄育苗试验后除去番茄根须后的混合物，CKP为蛭石育苗后的混合物。表1

表1 堆肥样品编号及处理
Table 1 Compost sample ID and its processing table

编号Number原料Raw material配方Formula菌剂Bacteria agent水Water(mL)时间Time(d)NA(YJF1.2)牛粪1 000 g1%麸皮1‰1 000 30YA(YJF1.3)羊粪1 000 g1%麸皮1‰1 00030JA(YJF1.1)鸡粪1 000 g1%麸皮1‰1 00030N5(YJF3.1)牛粪1 000 g1%麸皮-1 00030NAP(YJF2.1)NA 蛭石--30 YAP(YJF2.2)YA 蛭石--30JAP(YJF2.3)JA 蛭石--30N5P(YJF3.2)N5 蛭石--30CKP(YJF4.1)蛭石---30

1.2 方 法

1.2.1 样品总DNA提取及高通量测序

NA、YA、JA、N5发酵满30 d后翻料拌匀取样，NAP、YAP、JAP、N5P、CKP完成番茄育苗试验后除去番茄根须后混匀取样，参考陈竞等[15]的方法提取样品总DNA。将DNA送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行16S rDNA V4高通量测序。

根据物种注释结果，选取每个样品在门水平(Phylum)上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各样品在门水平上，相对丰度较高的物种及其比例。

1.2.2 粪肥样品实时荧光定量PCR

分别以甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)及类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)16S rDNA序列为模板，设计荧光定量PCR引物，甲基营养型芽孢杆菌的引物为M1 ：GAGAACAGATTTGTGGGATTGG，M2：CGTGTCGTGAGATGTTGGGT；类球红细菌的引物为GH3(F): GCCTCGGCCAAGACCAACC，GH4(R): GCTCGCCGGTGATGAAGATGGG，由上海生物工程技术服务有限公司合成。荧光定量PCR由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.2.3 粪肥理化指标

取样方法同上，各取三份，样品理化性质由新疆农业科学院农业节水与土壤肥料研究所完成，采用国标方法，检测项目有pH、有机质、EC值、总氮、总磷、总钾。

1.2.4 番茄育苗试验

将各自翻料拌匀的粪肥样品分别以1%添加量点样用于番茄的苗期肥效试验。以蛭石为基质，加水至湿润状态，放入浸泡后的番茄种子，再覆盖一层蛭石。室内光照条件培养，一周后幼苗长出2片子叶后，将有机肥分别施入基质中，距离幼苗根部1 cm左右。每天浇水，对照苗不施肥，同等浇水管理，记录其长势情况，观察各处理间幼苗的生长差异。

番茄育苗共做6个处理，其中4个添加粪肥处理样品，一个空白对照，一个营养液对照，30 d后每个处理随机抽样选取10株幼苗进行测量，录入数据均为平均数。

2 结果与分析

2.1 高通量测序

2.1.1 不同处理样品细菌门水平优势类群和相对丰度

研究表明，门水平物种相对丰度柱形图显示厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Cemmatimonadetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chloroflexi)、 蓝藻细菌门(Cyanobacteria)的微生物总量的比例大于97%。其中厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)占有绝对优势。其中，以牛粪样品的处理为例，添加菌剂的处理YJF1.2(NA)比不添加菌剂的处理YJF3.1(N5)功能菌群优势明显。育苗前后相比，未加菌剂的处理N5和YJF3.2(N5P)菌群结构变化不明显，而其余添加菌剂的处理菌群结构有明显变化，添加菌剂可改变育苗基质中微生物群落的结构。图1

图1 门水平上的物种相对丰度
Fig. 1 The relative abundance of the top bacteria at the Phylum level

2.1.2 不同处理样品丰度聚类热图

根据所有样品在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前35的属，根据其在每个样品中的丰度信息，从物种和样品两个层面进行聚类，绘制成热图，便于发现哪些物种在哪些样品中聚集较多或含量较低。纵向为样品信息，横向为物种注释信息，图中左侧的聚类树为物种聚类树；上方的聚类树为样品组间的聚类树。 图2

图2 物种丰度聚类热图
Fig. 2 Clustering analysis heatmap of bacteria based on the genus level

2.2 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)RT-PCR

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)和类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)样品DNA Real-Time PCR扩增，每个样品DNA做三个重复，Cp值相近，重复性较好。溶解曲线均为单峰，进一步证明标准曲线的准确可靠。图3～6

图3 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)基因扩增曲线
Fig.3 the amplification curve ofBacillusmethylotrophicusgene

研究表明，甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)和类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)在不同处理有机肥中的丰度均有所不同，在添加菌剂的粪肥处理样NA和JA中以及育苗后期样品NAP和JAP中均有很高的拷贝数，分别达到268×105、150×105、135×105和170×105。以牛粪和鸡粪为原料的粪便肥有利于腐熟菌剂中的甲基营养型芽孢杆菌和类球红细菌的增殖。图7、图8

图4 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)基因熔解曲线
Fig.4 the Melting curve ofBacillusmethylotrophicusgene

图5 类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)基因扩增曲线
Fig.5 the amplification curve ofRhodobactersphaeroidesgene

图6 类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)基因熔解曲线
Fig.6 the Melting curve ofRhodobactersphaeroidesgene

图7 各处理中甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)CP值及拷贝数
Fig. 7 The CP value and number ofcopiesofBacillusmethylotrophicusgene

图8 各处理中类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)CP值及拷贝数Fig. 8TheCPvalueandnumberofcopiesofRhodobacter sphaeroidesgene

2.3 样品理化指标

研究表明，牛粪添加辅料和菌剂NA发酵最终pH降至5.74，有机质达到56.74%，全氮5.23%，而对照N5的pH为8.93，有机质16.6%，全氮1.02%，添加辅料和菌剂能使肥料加快腐熟并酸化，大幅提升有机质和全氮含量，酸性有利于肥料保存和碱性土壤的改良，有机质和全氮是肥效的关键指标。表2

表2 主要理化指标分析结果Table2Mainphysiochemicalindexes

样品SamplepH值pH电导率EC(ms/cm)有机质(%)Organic matter全氮(%)Total nitrogen全磷(%)Total phosphorus全钾(%)Total potassiumYA4.789.0856.4705.122.021.82NA5.7410.2356.7405.231.612.27JA5.9010.3257.0305.702.882.13N58.395.9016.6001.021.202.18NAp9.850.971.2400.121.274.62JAp9.670.821.3900.111.804.50CKp10.200.671.2500.061.374.86

2.4 番茄育苗

研究表明，不同原料的处理优势菌群各有所不同，NA优势菌群为德沃斯氏菌属(Devosia)、农杆菌属(Agrobacterium)、乳酸菌(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)，YJF1.3(YA)优势菌群为不动杆菌属(Acinetobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、Turicibacter属，YJF1.1(JA)优势菌群是浮霉状菌属(Planctomyces)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)；育苗前后的处理相比，育苗前添加菌剂处理的粪肥样品NA、YA和JA其丰富度低而优势菌群种类单一，育苗后 YJF2.1(NAP)、YJF2.3(JAP)、YJF4.1(CKP)的优势菌群丰富度明显提高，表明腐熟粪肥的添加有助于番茄生长过程基质中菌群的多样化，其中NAP 中的丛毛单胞菌属(Comamonas)，NAP和JAP中的短波单胞菌属(Brevundmonas)和变形杆菌(Dyadobacter)，NAP、JAP和CKP中的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)和假单胞菌(Pseudpmonas)均有较高的丰度，而N5和N5P的腐熟样品和穴盘样品菌群变化则不明显。

研究表明，不同的处理方法对植株的4个指标影响各不相同，牛粪NA处理平均株高比对照组高47.16%；羊粪YA处理平均株高比对照组高46.28%；鸡粪处理JA平均株高比对照组高47.65%；牛粪不加菌剂处理的N5处理株高比对照组高3.62%。NA、YA、JA各项指标均显著高于对照组，表观性状叶色深绿且茎粗刚毛发达，肥效非常显著；而牛粪不加辅料和菌剂直接发酵的肥效不明显。营养液组叶色表现为嫩绿，茎粗相对较细，刚毛不发达。由于受到育苗人造光源等环境条件的限制，番茄苗整体长势较弱，但株高差异明显，只对比了株高数据。表3

表3 不同处理粪肥下番茄幼苗生长变化
Table 3 Effects of different treatments on the growth of Tomato Seedlings

编号Number株高Plant height叶数Number of blades子叶长Cotyledon length子叶宽Cotyledon lengthYA(YJF1.3)14.954.452.380.83NA(YJF1.2)15.045.452.620.75JA(YJF1.1)15.094.632.290.77N5(YJF3.1)10.593.092.110.79CK10.222.092.080.69营养液(Nutrient solution)12.092.722.230.74

3 讨 论

堆肥是由群落结构演替非常迅速的多个微生物群体共同作用而实现固体废物资源化、无害化的一个动态过程，微生物在其中发挥了主要作用，是决定堆肥发酵周期和品质的关键因素[16-17]。利用高通量测序手段得到所要研究的微生物群落中包含的所有DNA信息，通过这些序列信息可以从群落结构水平上全面认识微生物的特征和功能，高通量测序技术作为一种微生物免培养的快速检测技术，能够对粪肥样品中的大部分微生物进行种类和丰度鉴定，对于准确分析添加菌剂对粪肥腐熟过程菌群的影响具有重要的意义[18-19]。而RT-PCR技术可对粪肥腐熟中特定的功能微生物进行准确的定量分析，进而研究其生长和增殖规律[20]。研究结合这两种技术对粪肥腐熟过程中优势微生物群落结构和丰度、功能微生物的数量进行分析，探明了添加自筛腐熟菌剂对粪肥腐熟中菌群结构及其肥效的影响。结果表明，在牛、羊、鸡粪中添加自筛腐熟菌剂进行处理，可有效增加了粪肥中功能菌群数量、优化优势菌群结构、并促进肥料酸化、显著提高肥料有机质和全氮含量，腐熟后的粪肥对番茄苗期生长肥效显著。

4 结 论

在所有处理样品中，厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)占有绝对优势。其中，在牛粪样品的处理中，添加菌剂的处理NA比不添加菌剂的处理N5功能菌群优势变化明显；育苗前后相比，育苗前添加菌剂处理的粪肥样品NA、YA和JA其丰富度低但优势菌群却非常明显，育苗后NAP、JAP的优势菌群的丰富度明显增高，其中丛毛单胞菌属(Comamonas)、短波单胞菌属(Brevundmonas)、变形杆菌(Dyadobacter)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)和假单胞菌(Pseudpmonas)均表现较高的丰度，而未加菌剂处理的腐熟样品和穴盘样品N5和N5P菌群变化不明显。添加腐熟菌剂可明显促进粪肥中优势功能菌群的增殖，加快腐熟速度，菌剂处理的粪肥可明显改变育苗基质中微生物群落的结构，增加菌群丰富度和功能菌数量。添加菌剂能促进肥料酸化，提升有机质和全氮含量，酸性有利于肥料保存和碱性土壤的改良，有机质和全氮是肥效的关键指标。以牛粪和鸡粪为原料的粪肥有利于腐熟菌剂中的甲基营养型芽孢杆菌和类球红细菌的增殖，同番茄育苗试验结果一致。NA、YA、JA处理的育苗各项指标均显著高于对照组，番茄平均株高分别比对照组高47.16%、46.28%和47.65%。