地黄炮制蛇床子工艺条件研究

王 平，田茂军，刘 源

(六盘水师范学院 化学与材料工程学院，贵州 六盘水 553004)

1 引言

蛇床子，别名野胡萝卜子，为伞形科植物蛇床Cnidium monnieri(L.) Cuss.的干燥成熟果实，主要含挥发油、蛇床子素(Osthole)、异虎耳草素(Isopimpinellin)和花椒毒酚(Xanthotoxol)等化学成分[1,3]，其中蛇床子素(Osthole)是其主要活性成分，含量较高，约占总香豆素的60%[2]。蛇床子具有温肾壮阳、散寒祛风、燥湿杀虫之功效，临床上以外用为主，多用于治疗外科、妇科、皮肤诸疾[4-5]。蛇床子在《本经》中列为上品，蛇床子生用气味恶劣，损脾败胃令人作吐，若内服入煎及丸散等必须炮制后用。蛇床子的炮制在南北朝刘宋时代的《雷公炮炙论》中用浓蓝汁百部根自然汁浸后晒干再用生地黄汁拌蒸，唐代《理伤》中则用炒法，《本草述钩元》中用酒生地汁拌蒸。石继连等[6]对蛇床子炮制进行了研究，结果表明蛇床子素的含量随蛇床子的加热程度增加而减少，并且测定了蛇床子不同炮制品中总香豆素含量。沈迪等[7]对不同炮制工艺对蛇床子理化性质和蛇床子素含量的影响就行了研究，表明蛇床子炮制之后，蛇床子的主要活性成分蛇床子素的含量降低。田茂军等[8]对酒制蛇床子炮制工艺的正交实验法优选进行了研究，结果为最佳炮制工艺条件为加20 mL黄酒，闷润4 h，蒸2 h，此工艺稳定可行。田茂军等人[9]还对蛇床子不同炮制品中的总黄酮含量测定进行了研究，结果表明紫外分光光度法测定蛇床子不同炮制品中的总黄酮含量操作简便、结果准确、重现性好,实验方法切实可行。目前采用紫外分光光度计法测定地黄汁炮制蛇床子中总香豆素含量的研究，以及地黄汁制蛇床子的工艺鲜有报道。鉴于此，本文用地黄炮制蛇床子，在地黄汁的体积、蒸时间、闷润时间、浸蒸次数单因素实验的基础上，采用L9(34)正交进一步进行工艺优化实验，运用紫外分光光度计法测量其中总香豆素含量，以总香豆素含量为指标，获得地黄炮制蛇床子的最佳工艺，为地黄炮制蛇床子及内服提供基础性数据。

2 实验部分

2.1 仪器、材料与试剂

AL204型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；KQ-600DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；101B-1型恒温干燥箱(浙江萧山党山防爆电器厂)；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；万用电炉0-1000W(北京市泰和格润有限公司)。

生地黄(购买于河南省焦作市温县)，蛇床子为干品(购买于六盘水市老百姓大药房，产地河北)，香豆素对照品(上海如吉生物技术有限公司，纯度≥98%)；95%乙醇(分析纯)。

2.2 实验原材料的制备

鲜地黄冲洗干净，放入石研钵用研棒舂碎，为了避免和铁类物质接触，研棒采用木棒；生地黄舂碎后，纱布绞汁备用。

2.3 测定波长的选择

图1 香豆素对照品光谱扫描图
Fig.1 spectroscopic scanning of coumarin reference substance

图2 地黄制蛇床子样品总香豆素的光谱扫描图Fig.2 spectroscopic scanning of total coumarin in Rehmannia glutinosa

分别扫描香豆素对照品溶液和样品溶液在250～400 nm范围内的波谱，如图1、图2，结果发现对照品溶液和样品溶液在323 nm处都有一个吸收峰，能很好的进行定量测定，因此将323 nm作为测定地黄炮制蛇床子中总香豆素的测定波长。

2.4 单因素实验

2.4.1 地黄汁体积

图3 地黄汁体积对总香豆素含量影响
Fig.3 Effect of rehmannia glutinosa juice volume on total coumarin content

称取一定量的蛇床子生品，体积约30 mL，固定蒸时间2 h，闷润时间2 h，浸蒸次数为一次，考察地黄汁体积5 ，10 ， 15l， 20 ，25 mL 对地黄制蛇床子炮制工艺的影响，总香豆素含量分别1.907%，1.702%，1.320%，1.257%，1.089%，炮制品的颜色随着地黄汁体积的用量增加由绿黄色逐渐变为黑色，口感由入口麻辣转为入口先清凉而后才有麻的感觉。表明总香豆素的含量随地黄汁体积增大逐渐降低，但降低幅度逐渐减小。因此选择5 mL，15 mL，25 mL 为正交实验优化3个水平因素。

2.4.2 蒸时间

图4 蒸的时间对地黄汁炮制蛇床子中总香豆素的影响
Fig.4 Effect of steaming time on total coumarin in fructus cnidii prepared with rehmannia glutinosa juice

称取一定量的蛇床子生品，体积约为30 mL，固定生地黄汁体积15 mL，闷润时间为2 h，浸蒸的次数为一次，蒸的时间为2 h，4 h，6 h，8 h，10 h时对地黄制蛇床子炮制工艺的影响，总香豆素含量分别为1.442%，1.536%，1.723%，1.321%，1.145%。总香豆素的百分含量与蒸的时间之间关系曲线如图2.2.2所示。从图中可以看出总香豆含量随蒸时间增加含量缓慢增加后又降低因此选择2 h， 6 h，10 h为正交实验优化3个水平因素。

2.4.3 闷润时间

图5 闷润时间对地黄汁炮制蛇床子中总香豆素的影响
Fig.5 Effect of Moistening Time on Total Coumarin in Fructus Cnidii Prepared with Rehmannia glutinosa Juice

称取一定量的蛇床子生品，体积约为30 mL，固定生地黄汁15 mL，蒸时间为 2 h，浸蒸的次数为一次，闷润时间为2 h，4 h，6 h，8 h，10 h时对地黄制床子炮制工艺的影响，测定其总香豆素含含量分别为1.231%，1.450%，1.435%，1.394%，1.140%。表明总香豆含量随闷润时间增加含量缓慢增加后又降低，因此选择2 h，6 h，10 h为正交实验优化3个水平因素。

2.4.4 地黄汁浸蒸的次数

图6 蒸的时间对地黄汁炮制蛇床子中总香豆素的影响
Fig.6 Effect of Steaming Time on Total Coumarin in Fructus Cnidii Prepared with Rehmannia glutinosa Juice

称取一定量的蛇床子生品，体积约为30 mL，加入生地黄汁15 mL，闷润时间为2 h，蒸的时间为2 h，浸蒸的次数分别为一次，二次，三次对地黄制蛇床子炮制工艺的影响，测定其总香豆素含量分别为17.01%，1.435%，1.290%，总香豆素含量随浸蒸的次数增加而逐渐降低。

2.5 总香豆素含量测定

2.5.1 标准溶液的制备

准确称取蛇床子素对照品0.0200 g，用80%乙醇溶解，定容到100 mL容量瓶，即得浓度为200 μg/mL的蛇床子素标准溶液，备用。

2.5.2 标准曲线的制备

移取蛇床子素标准溶液0.25,0.50,1.00 ,2.00 ,4.00 mL于50 mL容量瓶中用80%乙醇定容，即得溶液为1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、4.00 μg/mL、8.00 μg/mL、16.00 μg/mL、32.00 μg/mL的标准曲线待测定溶液。紫外分光光度法测定标准溶液的浓度，以80%乙醇作为空白参比，在323 nm处测定。以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得标准曲线的线性回归方程(C=15.83778*A-0.40145 R2=0.9995)，由线性回归方程可知蛇床子素溶液浓度在1.00-32.00 μg/mL范围内，蛇床子素标准溶液吸光度与浓度的线性关系良好。

2.5.3 样品溶液的制备

准确称取样品0.5000 g置于锥形瓶中，加入80%乙醇30 mL浸泡后，超声提取60 min(设定功率为60%)，然后进行过滤，滤液用80%乙醇定容到50 mL容量瓶，即得样品溶液。

2.6 正交实验

根据单因素实验的研究数据，进一步优化工艺，选取影响蛇床子炮制各因素中有意义的水平做正交实验，对结果进行极差分析，以确定最佳的提取条件。采用L9(34)正交表，以地黄汁体积(A)、蒸时间(B)、闷润时间(C)、浸蒸次数(D)作为4个考察因素，选取3个水平进行实验。

表1 地黄制蛇床子的炮制工艺正交实验因素水平Table 1 Level of factors in orthogonal test for processing technology of Rehmannia glutinosa Cnidii

按表1的正交因素水平设计L9(34)正交实验，结果见表2。

表2 地黄制蛇床子的炮制工艺正交实验设计及结果Table 2 Orthogonal experimental design and results of processing technology of Rehmannia glutinosa Cnidii

由表2的极差分析结果可以看出，RA>RB>RD>RC，4个因素对地黄汁炮制蛇床子的影响大小依次为：地黄汁的体积(A)>蒸的时间(B)>浸蒸的次数(D)>闷润时间(C)。四个因素中，地黄汁的体积、蒸的时间和浸蒸的次数较为显著，其中影响最大的是地黄汁的体积。在实验设计范围内，优化得到地黄汁炮制蛇床子的最佳条件为A1B2C1D1，即地黄汁的体积为5 mL，蒸的时间为6 h，闷润的时间为2 h，浸蒸的次数为一次。

2.7 验证实验

按A1B2C1D1(地黄汁体积10 mL，蒸时间4 h，闷润时间2 h，蒸次数1次)条件进行3次平行炮制，三次蛇床子炮制品中总香豆素百分含量分别是1次：1.123%，2次：1.130%，3次：1.119%，3次平行实验总香豆素平均百分含量值为1.124%，符合2010版《中国药典》质量标准。

3 结果与讨论

(1)实验选择香豆素对照品作为对照，在波长为250～400 nm处，应用紫外可见分光光度法对香豆素对照品和样品中香豆素进行测定，结果发现香豆素对照品和样品在323 nm处都有一个吸收峰，能很好的进行定量测定，因此将323 nm作为测定的波长。紫外可见分光光度法测定地黄制蛇床子中香豆素操作简便、结果准确、灵敏度高、重现性好，在测定地黄制蛇床子中香豆素含量中是切实可行的。

(2)实验采用正交实验法优选得出地黄汁炮制蛇床子的最佳工艺条件如下：地黄汁体积为5 mL，蒸时间为6 h，闷润时间为2 h，浸蒸的次数为一次，蛇床子炮制品中的总香豆素含量为1.124%，符合2010版《中国药典》质量标准。

(3)在地黄汁炮制蛇床子过程中，炮制品的颜色随着地黄汁体积的用量增加由绿黄色逐渐变为黑色，口感由入口麻辣转为入口先清凉而后才有麻的感觉。但地黄汁的体积用量增大炮制品中蛇床子中的香豆素含量降低，浸蒸的次数也影响炮制品的口感。因此若不考虑炮制品中总香豆素含量的前提下适当增加地黄汁的体积和浸蒸的次数，以达到消除其辣味，实现炮制服用的目的。