负离子化学源气相色谱/质谱法检验三唑仑

文/姜红 侯小平 何毅 崔巍

以丙酮、氯仿为萃取剂，采用负离子化学源气相色谱/质谱法对生物检材中的三唑仑进行了分析检验 // 三唑仑分子结构中含有电负性较大的卤族元素氯（Cl），应用负离子化学源进行检验可以极大地提高检测灵敏度，得到了较为满意的检验结果，该方法可用于公安机关实际办案。

三唑仑（Triazolam，又称海乐神、酣乐欣、三唑苯二氮卓），化学名为8-氯-6-氯苯-1-甲基-4H-三唑仑，[4,3a][1,4]-苯并二氮卓（C17H12Cl2N4），属三唑苯二氮卓类（benzodiazepines）安眠镇静药物，临床上常用来治疗抗焦虑和失眠。三唑仑纯品为白色或淡黄色结晶粉末，几乎无味，溶于氯仿，稍溶于乙醇，微溶于水和乙醚。药用为蓝色片剂，每片含0.25 mg三唑仑，服用半片就有明显的催眠作用，血中浓度高于4 ng/mL就会产生明显的镇静作用。

因为三唑仑属于新型高效安眠、镇静药，药效极强（少量使用即产生药效），在市场上有售，易于获得。所以，在近年来的麻醉抢劫、强奸案件中，三唑仑是案犯经常使用的麻醉药物之一。三唑仑进入体内后，在血中以原体形式存在，在尿中原体含量低于1%，而其代谢产物α-羟基三唑仑却占60-80%。由于三唑仑代谢速度快，体内组织及体液中含量极微，这给检验工作带来一定的困难，目前国内外分析三唑仑及其代谢产物α-羟基三唑仑的方法有：GC-NPD法、GC-ECD法、HPLC法、GC/MS和GC/MS/MS法，本文采用负离子化学源气相色谱/质谱法（NCI-GC/MS）检验生物检材中的三唑仑，该方法操作迅速、简便，干扰小、灵敏度高，结果准确可靠，可直接用于公安基层办案。

实验部分

检测器温度：280 ℃；

柱温（程序升温）：80 ℃（2 min）30℃ /min 280℃（16.5 min）；

分流比 ：20：1 ；

总流量：2 mL/min；

质谱数据采集模式：全扫描;

扫描范围：40-450 m/z；

电子倍增器电压：1.0 kV。

实验方法

首先要对检材进行前处理：取检材血5 mL（或尿5 mL、胃内容物、肝各 5 g），用丙酮 -水（9：1）20 mL浸泡，超声萃取20 min。离心分离，上清液在水浴80℃下，浓缩至2 mL。调pH=10，用氯仿10 mL振荡、提取5 min，离心分离，分出氯仿。再用10mL氯仿提取一次，合并两次提取液，在50℃下挥干氯仿，用100μL甲醇溶解，然后经GC/MS进行分析。

结果与讨论

实验仪器

GCMS-QP5050A（岛津公司）；

离子源：NCI源（负离子化学源）；

载气：CH4、He.

实验条件

色谱柱：J&W DB-5（30 mX 0.25 mm X 0.25μm）毛细管柱；

传输线温度：250 ℃；

进样口温度：280 ℃；

利用负离子化学源气相色谱/质谱法检验三唑仑的理论依据

因为三唑仑多从尿中代谢并排出，所以在麻醉抢劫、强奸案中，尿液是最好的检材。但因尿中药物原体极微，难以检测，所以对尿液中三唑仑的分析多是以检测其代谢产物α-羟基三唑仑为主。而三唑仑的代谢物在尿中并非以游离状态存在，而是与葡萄糖醛酸结合，形成共轭化合物，所以检测尿中的代谢物必须先水解，使之从结合态中游离出来，才能有效地将其提取出来。又由于三唑仑的代谢物含有羟基，需要衍生化后才能进样分析，因此前处理过程比较繁琐且比较费时。而用负离子化学源气相色谱/质谱法检验三唑仑，大大简化了前处理过程，提取步骤较少，操作简便快速。

化学电离是利用样品蒸气分子与甲烷等反应气体的离子相互作用（分子-离子反应）而使样品分子离子化。由于分子-离子反应过程并不给予分子离子过多的能量，因而减少了分子离子进一步裂解的几率，增加了分子离子峰强度，减少了碎片离子峰，常常生成质子化的分子，这些离子称为准分子离子，因此化学电离属于一种软电离技术。它的优点是，即使对于不稳定的有机化合物，也可得到相对丰度较大的分子离子峰，提供了样品分子量的信息。负离子化学源，是高亲电化合物的一种极灵敏、选择性极强的质谱分析法，它弥补了正离子CI和EI法灵敏度低的缺陷，对卤素类化合物灵敏度非常高，其灵敏度可以和电子捕获检测器（ECD）相媲美。

利用负离子化学源气相色谱/质谱法检验三唑仑的优势

在麻醉抢劫、强奸案件中，尿液是最好的检材，其次是血液。三唑仑在体代谢速度快，体内组织及体液中含量极微，在体内尿液中含量低达10-10。三唑仑具有高亲酯性，易溶于生物膜的类脂质中而扩散。在胃肠道很快通过毛细血管壁而被吸收到血液中，在血浆中与血浆蛋白的结合率达90%。但它在血液中存留时间很短，很快就在肝脏中进行代谢并随尿排出，三唑仑在血浆中最大治疗浓度仅为0.02 µg/mL，因此它在血液中浓度也很低,见表1。特别是对麻醉抢劫、强奸案件中的活体检验用质谱法直接定性难度较大，而用其他方法对体内检材一般也检不出来，因为三唑仑的沸点较高，一般在GC（FID、NPD检测器）、GC/MS（EI源）等仪器上响应很低，所以在实际办案中很容易漏检，因此常常使案件的侦破工作陷入僵局。而采用负离子化学源气相色谱/质谱法检验三唑仑，效果较好，因为三唑仑分子结构中含有卤族元素，（含有二个氯原子），应用负化学源可以极大地提高检测灵敏度，得到满意的结果。

表1 三唑仑在血浆中的有关浓度（ng/mL）。

案例应用

案例1

X年X月X日，41岁的刘某某被3名犯罪嫌疑人杀死并被分尸，尸体分多处埋藏。半年后侦查人员将其尸体挖出三块，均已高度腐败。将其送到公安部物证鉴定中心进行检验，理化检验人员对送检的死者的胃及胃内容、肝组织分别进行了检验。首先用有机溶剂进行提取，然后用GC/ECD、GC/MSNCI进行分析，从送检的死者的胃及胃内容、肝组织中均检出三唑仑成分，肝组织中三唑仑的含量为1.36 µg/g，进而为案件的侦破，提供了科学的证据。

案例2

X年X月X日，江西省某地一年轻女子刘某，被一中年男子骗至当地一旅社中，该男子诱骗刘某喝下1罐饮料，致使刘某昏迷，遂对刘某进行强奸，并抢走现金、首饰及手机等物品。办案人员将受害者刘某的尿液，送至公安部物证鉴定中心进行检验，首先将受害者刘某的尿液用有机溶剂进行提取，然后用GC/ECD、GC/MS-NCI进行分析，在刘某的尿液中检出麻醉药物三唑仑的成分，为确定案件的性质提供了有力的证据。

案例3

X年X月X日晚9时许，湖南省某地3位看管园林的老人，在喝了他人送的牛奶后昏睡不醒，待第二天醒后3人发现门前一棵珍贵的树木—罗汉松已被挖走。刑技人员对受害人李某醒后的第一泡尿液进行了提取，并送到公安部物证鉴定中心进行分析检验。经对受害人李某醒来后的第一泡尿液进行GC/ECD、GC/MS-NCI分析，检出麻醉药物三唑仑的成分。

图1 案例1中三唑仑的总离子流图。

图2 案例1中三唑仑的质谱图。

图4 案例3中三唑仑的总离子流图。

结语

麻醉抢劫、强奸案件的发生具有很大的社会危害性，不仅会给受害者造成财物损失，同时也极大地危害了受害人的身心健康。为了更有力地打击这类犯罪案件，为案件的侦破提供线索，指明方向，为证实犯罪提供科学的依据，必须建立一套完整、系统的对三唑仑及其代谢物在生物体内的分析检验方法，以便及时、准确地对其进行定性和定量分析。实验结果表明：对于麻醉抢劫、强奸案件中体内组织及体液中的麻醉药物，可采用负离子化学源气相色谱/质谱法进行检验，该方法操作简便、快速、干扰小、灵敏度高，结果准确可靠，可直接用于公安基层办案，此方法可作为法庭科学实验室中分析检验麻醉药物的一种简单而快速的方法。