Cary 3500多池紫外-可见分光光度计用于蛋白质分析的优势

文/Kevin Grant,Matt Quinn

提高极小体积样品定性和定量测量的效率和重现性 // 紫外-可见分光光度计测量为样品的质量控制检查提供了一种快速可靠的方法。它们还可用于计算比活性或估算纯化后的产率，并鉴定含有蛋白质和氨基酸的组分。

含有芳香侧链氨基酸的蛋白质，在接近280 nm处产生吸收。因此可以使用紫外-可见分光光度计进行定量分析。当吸收系数已知时，可根据比尔-朗伯定律确定含有氨基酸的蛋白质的浓度。通常蛋白质的样品量有限，以最少体积进行测量对于样品的保存至关重要。通过波长扫描可提供潜在污染物的信息。Cary 3500多池紫外-可见分光光度计具有永久光学准直的集成式多池支架，与超微量比色皿（如图1所示），配合使用，适用于可靠、可重现的定性及定量测量。依据Cary 3500多池紫外-可见分光光度计在小体积蛋白质样品定性和定量分析方面的优势。以牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA) 为蛋白质标准品进行本次实验。

实验部分

样品

配制 pH 7.0 的 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液 (PBS)。

配制10 mg/mL BSA 储备液，并稀释至 0.75、1.50、2.25、3.00和3.75 mg/mL。

使用六个孔径为2×2.5 mm，容积70 µL，光程10 mm的超微量比色皿进行测量，见图1。其中，一个作为参比，五个作为样品。使用3.5 mL、10 mm光程的标准石英比色皿进行重现性测量。采用PBS 缓冲液作为参比溶液。

图1 Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计具有高度聚焦的光束，宽度小于1.5 mm。

仪器和方法

所有测量均使用Cary 3500多池紫外-可见分光光度计。在250-350 nm范围内进行波长扫描，信号采集平均时间为1秒，数据间隔为1 nm。无需预先校准系统

为证明重现性，用超微量比色皿(70 µL) 重复测量3.0 mg/mL BSA 溶液20次，其中参比位置为装有 PBS 缓冲液的相同超微 量比色皿。此外，使用3.5 mL、10 mm光程的标准石英比色皿对同样的溶液进行另外20次重复测量，以装有PBS缓冲液的相同比色皿作为参比。这些测量均在278 nm处进行，信号采集平均时间为1秒，光谱带宽为2 nm。

结果

同步测量

空白样品和五种浓度BSA样品在Cary 3500多池紫外-可见分光光度计中使用超微量比色皿（2×2.5 mm孔，10 mm光程）进行同步测量。在250-350 nm范围内进行波长扫描以定性分析样品，见图 2。然后将这些数据用于评估仪器的线性（参见下文微量池部分中的线性）。

图2 70μL 超微量比色皿中同步收集的五种浓度 BSA 样品的波长扫描结果。

蛋白质纯度350 nm处的吸收强度可用于定量和校正存在于蛋白质样品中的任何污染物。从图2可以看出，该测量样品在350 nm处的吸光度为0 Abs。因此，这些样品中BSA的浓度与光谱图的峰最大值成正比，根据这一关系可准确测定BSA的浓度。无需杂质校正。

微量池线性

很明显，每个BSA波长扫描的峰最大值均出现在278 nm处，见图 2。使用Cary 3500紫外工作站软件提取每个样品在278 nm处峰的吸收强度，并将其对每种所测样品中的蛋白质浓度作图，如图3所示。这些数据清晰地展示了Cary 3500系统的线性，见图3。结果表明，线性范围扩展至接近2.5 Abs，即使使用小孔超微量比色皿也是如此。

重现性

为 证 明 重 现 性， 在 70 µL、2×2.5 mm孔径的超微量比色皿或3.5 mL标准比色皿中重复测量3.0 mg/mL BSA 样品20次。 两种比色皿的光程均为10 mm。超微量比色皿较小的窗口孔径尺寸对测量的重现性（标准偏差）无影响，如图4 所示。70 µL超微量比色皿的测量标准偏差为0.00042，3.5 mL标准 比色皿为0.00029。使用超微量比色皿测得的吸光度平均值为1.863 Abs。使用3.5 mL标准比色皿测得的吸光度平均值为1.858 Abs。两种比色皿所得结果的差异在仪器的测量不确定度范围内。

使用小体积比色皿的风险在于较小的比色皿窗口（通常为比色皿设计的一部分）孔径导致光通量减小。光通量减少会使线性吸光度范围和测量重现性降低。Cary 3500具有高度聚焦的光束，可确保以最大光通量通过样品，且重现性与3.5 mL标准比色皿相同，如图4所示。

讨论

如果已知吸收系数，可通过紫外-可见光谱图上的最大吸收强度进行定量测量，如此处测量的BSA样品，其吸收系数已知。如果吸收系数未知，则必须通过测量多个标准品建立校准曲线，并根据校准曲线的斜率计算吸收系数。这是一个耗时的过程，并可能引起在实验结束前都无法确定的测量误差。分析人员可以选择在分析序列中加入已知浓度的样品来提高数据的可靠性。这些加入的样品充当内部对照。这种测量方法的问题在于不能同时测量样品和标准品，因而在样品和标准品测量之间各种变量可能发生改变。如本文所述，同步进行样品和标样测试可大大减小其他环境变量或可能影响样品前处理的偏差。

在测量可能不稳定的样品时，一次测量一个样品的方法可能会导致结果错误。将样品置于实验台等待测量的过程中，它们的吸光度可能会发生改变。引起这一改变的原因可能为温度变化、照射到溶液的光线的影响或溶液中的化学变化。这可能导致定量测量时出现系统误差。通过同步测量所有比色皿位置，Cary 3500多池紫外-可见分光光度计可消除这些不利变量，并提高所生成结果的可靠性。同时，还可显著节省测量时间。

图3 对五种BSA样品278 nm处的吸光度和浓度作图，展示了Cary 3500多池紫外-可见分光光度计的线性。

图4 70μL超微量比色皿与3.5 mL标准比色皿重复测量20次的吸光度比较。

结论

Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计为蛋白质的定性和定量分析带来了新的可能。该系统采用独特的非移动式整体多池支架，专为提高分析效率和重现性而设计。通过同步测量八个比色皿位置，可有效减少任何可能在后续测量过程中出现的不利变量。这些特点共同造就了一个强大的分析型紫外-可见分光 光度计系统。