液相梯度洗脱中溶剂纯度对色谱行为的影响

文/汪德家

在等梯度洗脱过程中我们往往会忽略溶剂纯度对色谱行为的影响 // 这种影响在HPLC中尚不明显，但是在UPLC中情况有所变化。使用纯度较差流动相在实验开始阶段可能影响尚不明显，随着实验的深入，杂质积聚，实验结果将不可避免的出现偏差，选择纯度符合实验要求的洗脱溶剂，保障实验结果的精确可靠。

高效液相色谱(HPLC)和超高效液相色（UPLC）是应用高效液相色谱原理，主要用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定的和分子量大的有机化合物的仪器设备，其广泛应用于生命科学、食品科学、药物研究以及环境研究中。

一般而言，液相色谱有等强度和梯度洗脱两种洗脱方式。等度洗脱是指在同一分析周期内流动相组成保持恒定,适合于组分数目较少,性质差别不大的样品。梯度洗脱是指在一个分析周期内程序控制流动相的组成如溶剂的极性、离子强度和pH值等,用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间,提高分离度,改善峰形,提高检测灵敏度,但是常常引起基线漂移和降低重现性，为此需要采取一些措施，如流动相按一定比例预混等，以达到消除基线波动，提高重现性的目的，在此过程中我们往往会忽略溶剂纯度带来的影响，在HPLC中溶剂纯度的影响尚不明显，但是在UPLC中情况有所变化。UPLC因为使用更小颗粒填料、更快流速进行快速检测，流动相纯度差的影响会迅速积聚，基线漂移程度加重，实验不能重现，甚至出现鬼峰，倒峰等，从而影响实验结果，造成资源的浪费，特别是杂质分析，含量测定等实验，我们更需要关注流动相的纯度，以尽可能的使实验结果接近真实值。

实验部分

仪器与材料

乙腈和甲醇(色谱纯，上海星可试剂)；

乙腈和甲醇(色谱纯，进口试剂)；

Agilent 1200液相色谱系统；；

Waters Acquity UPLC液相色谱系统；

Agilent@C18(5.0um4.6*250mm)；

CORTECS@C18 (2.7um4.6*50mm)。

HPLC色谱条件

Agilent 1200液相色谱系统；

色谱柱：Agilent@C18(5.0um4.6*250mm)；

流动相A为纯水，流动相B为乙腈，洗脱梯度见表1 ；

柱流速2.0 ml/min；

柱温25℃

检测波长：210 nm和254 nm。（甲醇的检测条件与乙腈相同，但检测波长分别为235 nm和254 nm）

表1 HPLC的洗脱梯度。

UPLC色谱条件

Waters Acquity UPLC液相色谱系统；

色谱柱：CORTECS@C18(2.7um4.6*50mm)；

流动相A为纯水，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序见表2；

柱流速1.0 ml/min；

柱温：40℃；

检测波长： 200 nm和254 nm。

（甲醇的检测条件与乙腈相同）

表2 UPLC的洗脱梯度。

结果

HPLC实验结果

由按照ACS标准程序洗脱法分析溶剂的洗脱特征为平滑的洗脱曲线，杂质峰几乎接近仪器信号的噪音水平，杂质水平达到HPLC仪器的最低检测能力，所有品牌甲醇和乙腈都达到检测标准，对HPLC分析结果几乎不存在影响。

UPLC实验结果

由图1可知，在200 nm下甲醇梯度变化为平滑曲线，各品牌甲醇在此条件没有明显区别，但在254 nm下色谱图中出现杂质，比较不同厂家的甲醇，其中上海星可试剂生产的甲醇相对于进口的甲醇对实验的干扰最小。

图1甲醇UPLC梯度洗脱色谱图。

由图2可知，各厂家生产的乙腈在UPLC条件下均对实验结果有一定的影响，其杂质种类和水平相差不大，综合考虑，可能上海星可试剂生产的乙腈，纯度更高，对实验结果干扰较小。

图2乙腈UPLC梯度洗脱色谱图。

讨论

色谱系统的维护和故障排除最简便的途径就是不要完全被动地去应付各种问题，在实验前，我们需要有一个全面的考量，对于实验中可能出现的问题做好预防措施，如定期更换密封垫圈，更换新的保护柱等。此时作为洗脱溶剂的流动相的纯度更是不容忽视的，使用纯度较差流动相在实验开始阶段可能影响尚不明显，随着实验的深入，杂质积聚，实验结果将不可避免的出现偏差，按照正常的故障排除逻辑推理将要花费大量的精力，在排除各种可能存在的仪器故障后才可能意识到流动相的纯度问题。

目前，大量精密实验使用进口试剂，以尽可能减少流动相带来的干扰，但我们也应该看到，随着我们国家的迅速发展，国内出现了很多优秀的试剂生产企业，其生产工艺已经接近国际先进水平，产品品质也已经和进口产品相差无几，可以作为进口产品的替代，甚至在UPLC中对杂质的检出限还略有优势。