基于EGFR-MUC5AC信号通路探讨参鱼化痰口服液干预慢性阻塞性肺疾病大鼠气道黏液高分泌的机制*

李天浩，韩晨旭，王惠琴，任加良，马建刚

陕西中医药大学第二附属医院(咸阳 712000 )

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是呼吸系统常见疾病，以慢性、反复加重的咳嗽、咳痰为其主要临床表现，疾病晚期合并呼吸衰竭、肺心病，危及患者的生命。研究发现，COPD患者气道黏液分泌明显增多，即使在疾病缓解期，也处于较高分泌状态，这种慢性黏液高分泌既是引起慢性咳痰的原因，也使患者更容易发生肺部感染，已成为COPD的独立危险因素[1-4]。中医治疗COPD具有多靶点、毒副作用少的优点，目前用于临床的中药复方制剂并不鲜见。参鱼化痰口服液是我院院内制剂，是由清肺化痰逐瘀汤加工而成，应用临床疗效显著，前期研究表明，可明显减轻COPD患者咳嗽、咳痰等症状，降低COPD 患者血清CRP、IL-6、MMP-9水平，升高 SOD 水平[5-7]。本研究通过观察参鱼化痰口服液对COPD大鼠气道上皮中杯状细胞和粘蛋白 MUC5AC表达的影响，探讨参鱼化痰口服液干预COPD大鼠气道黏液高分泌的可能作用机制。

材料与方法

1 实验动物 清洁级、雄性SD大鼠36只，180～220g，购于西安交通大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(陕)2012-003。实验大鼠分笼饲养，自由饮水进食，适应性喂养3～7 d。本研究符合陕西中医药大学实验动物伦理委员会相关要求并审批通过。

2 实验试剂 参鱼化痰口服液(处方组成为：鱼腥草、桑白皮各12 g，丹参20 g，黄芩、杏仁、浙贝母、全瓜蒌、当归、厚朴各9 g，大黄、水蛭、干姜各3 g，20 ml/支，每支相当生药1 ml/1 mg)(陕西中医药大学第二附属医院制剂室)；大前门香烟；脂多糖(LPS)、大鼠MUC5AC单克隆抗体均购于美国Sigma公司；自制1 m3烟熏箱，周围有1 cm×1 cm通气孔；MUC5AC免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；Image-Pro Plus图像分析软件，美国Media Cybemetics公司。

3 实验方法

3.1 实验分组及模型建立：将大鼠随机分为空白组、模型组、中药组(参鱼化痰口服液组)，每组12只，参照文献方法[8]建立大鼠COPD模型。将模型组、中药组大鼠置于1 m3的特制烟室中，每日用锯末50 g、香烟10支，点燃进行烟熏，每日烟熏40 min，1 d1次，连续28 d。分别于第1天，第14天，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)经腹腔内注射将大鼠麻醉，然后经鼻腔滴入浓度为0.4 mg/ml的LPS液200 μg，并于当天停止烟熏。

3.2 给药方法：各组大鼠于试验第1天起开始灌胃给药，连续28 d。中药组于试验第1天开始给予参鱼化痰口服液(剂量按4.2 mg/kg体重计算，然后加生理盐水至10 ml)灌胃，空白组和模型组仅给予等量生理盐水灌胃，1次/d，连续28 d。

3.3 标本采集及处理：给药28 d后，以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)经腹腔内注射麻醉大鼠，迅速取下右肺，并用10%多聚甲醛液固定后，取材常规石蜡包埋、切片，行ABPAS染色。

4 观察指标

4.1 支气管肺组织ABPAS染色病理标本制备：石蜡切片常规脱蜡、水洗，以阿尔辛蓝浸染30 min，后以3%醋酸浸染3 min，再水洗，0.5%H2O210 min，蒸溜水冲洗，入Schiff液染色20 min，无水乙醇脱水，中性树胶封固。光镜观察支气管肺组织病理改变(杯状细胞呈红色，黏液呈蓝色)。

4.2 杯状细胞阳染率检测：每组随机选取3张切片，每张再随机选取5个视野，高倍镜下计数每个视野杯状细胞阳染数。

4.3 免疫组织化学检测MUC5AC的表达：采用二步法,严格按试剂盒说明书进行操作，采用mage-Pro Plus图像分析软件进行光密度(Optical density，OD)值分析。

5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠支气管肺组织ABPAS染色病理结果 空白组大鼠各级支气管可见少量杯状细胞及少量粘液分泌。模型组支气管可见大量杯状细胞，且粘液分泌明显增多，肺泡上皮细胞变性、坏死，甚至脱落，间质可见充血、水肿改变。中药组总体杯状细胞数及黏液分泌较模型组明显减少(图1)。

图1 各组大鼠支气管肺组织ABPAS染色病理结果(ABPAS染色，×200)

2 各组大鼠气道杯状细胞计数结果 见表1。空白组大鼠气道上皮杯状细胞数较少，与空白组比较，模型组大鼠气道上皮杯状细胞数显著增多，差异有统计学意义(P<0.01)，中药组杯状细胞数也增多，差异有统计学意义(P<0.05)。但与模型组比较，中药组杯状细胞数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 各组大鼠MUC5AC蛋白的测定结果 见表2。空白组大鼠MUC5AC轻度表达，模型组明显升高，与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；中药组轻度升高，差异有统计学意义(P<0.05)；经中药干预后，中药组大鼠MUC5AC的表达减低，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠气道杯状细胞计数结果比较(个)

注：与空白组比较，◇P<0.01；与模型组比较，*P<0.05

表2 各组大鼠MUC5AC蛋白表达光密度值比较(OD值)

注：与空白组比较，△P<0.05，◇P<0.01；与模型组比较，*P<0.05

讨 论

气道黏液主要是由支气管黏膜中的黏液腺和杯状细胞分泌的，其粘弹性主要取决于黏液中粘蛋白(Mucin，MUC)的含量[9]，而MUC主要是由杯状细胞分泌。到目前为止，已发现编码MUC的基因19种，与人类COPD关系最为密切的主要是MUC5AC和MUC5B[10]。引起气道黏液高分泌的主要刺激物是一些细胞因子和其它一些炎性介质，如IL-1、IL-8、IL-13及组胺、PG、TNF-α等，主要调节MUC5AC和MUC5B的表达，同时促进杯状细胞增生[11-14]。研究发现，介导杯状细胞增生以及MUC合成的关键信号通路是表皮生长因子受体(EGF-R)酪氨酸激酶信号通路，当气道受到上述细胞因子和炎性介质刺激后，活化的EGFR将细胞外信号传到下游信号分子，启动MUC5AC基因转录，导致MUC合成、分泌增加[15-16]，选择性EGF-R 酪氨酸激酶抑制剂可以抑制杯状细胞增生[17]，下调MUC5AC mRNA的表达[18]。

气道黏液高分泌是COPD等慢性气道疾病的重要病理特征之一，黏液高分泌会导致气道阻力增加、肺功能下降，细菌容易在气道内繁殖，引发COPD急性加重，同时也影响纤毛运动，降低纤毛清除能力，形成恶性循环。因此，治疗气道黏液高分泌必然会减少急性发作次数，延缓疾病发展，具有重要的临床意义。

COPD属中医肺胀、喘证、咳嗽等范畴，是由于疾病迁延不愈以致肺、脾、肾三脏亏虚。肺虚宣发肃降失司，痰浊内生；脾虚运化失司，水湿内停成痰；病久及肾，肾虚温煦失司，三焦气机不畅，水湿内停，聚而成痰。痰湿日久郁而化热，肺气不宣，咳喘而生。病久入络，气机阻遏，脉络瘀阻，遂成血瘀之证，故COPD 的主要病机是痰湿、肺热、血瘀。

参鱼化痰口服液是我院院内制剂，是由清肺化痰逐瘀汤研制而成，处方组成为：鱼腥草、桑白皮、黄芩、杏仁、浙贝母、丹参、全瓜蒌、当归、厚朴、大黄、水蛭、干姜等。方中鱼腥草、桑白皮、黄芩、浙贝母、杏仁清肺化痰，平喘止咳；瓜蒌主要清上焦之热，化痰浊，开胸逐瘀；当归、丹参活血、化瘀、通络；水蛭破血、逐瘀、通络；厚朴化湿、降气、平喘；大黄通腑、泄浊、清热、逐瘀；干姜温中散寒，全方共奏清肺化痰、活血化瘀之功效。

本研究表明，参鱼化痰口服液可抑制COPD大鼠支气管肺组织中杯状细胞增生，减少MUC的表达，从而减轻气道黏液高分泌，其机制可能是通过干预EGFR-MUC5AC信号通路来实现。