西罗莫司对大鼠肾间质纤维化的防治作用及机制研究

米海燕 罗湘俊

(南华大学附属南华医院肾内科,衡阳421002)

肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是由多种原因引起的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)在肾间质中的过度累积和成纤维细胞的增殖而形成，是发生于多种类型肾脏病的共同途径和主要病理转归，其主要病理特征为肾间质炎症细胞浸润以及肾小管萎缩等[1]。自20世纪70年代开始，大多数学者认为单侧输尿管梗阻动物的肾脏病理改变与人体肾间质纤维化相似[2]，可以在一定程度上反映人类肾纤维化的病理特征，所以后来采用动物单侧输尿管梗塞制作肾脏间质纤维化实验模型被广泛应用于实验研究中[3]。西罗莫司(Sirolimus，Sir)主要应用于肾脏、肝脏、胰岛移植患者，属哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂，具有明显改善慢性移植物肾病作用，主要表现在延缓肾纤维化[4]。本实验采用大鼠单侧输尿管梗阻手术制备肾间质纤维化模型，首先对大鼠进行单侧输尿管结扎，以时间分组，观察不同时间点肾间质纤维化大鼠肾脏的病理变化，记录成造模时间节点。根据该方法，在手术当天复制模型并将西罗莫司胃内注射给模型大鼠，通过分析阻塞性肾间质病变情况、TGF-β1表达及其相关基因表达等情况，探讨西罗莫司减轻大鼠肾间质抗纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠36只，体重(180±20)g。西罗莫司购于辉瑞公司。山羊抗兔TβR-Ⅰ(CST 公司)，山羊抗小鼠α-SMA(Sigma 公司)、兔抗大鼠TGF-β1抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，Trizol 试剂盒(美国 Invitrogen公司)。逆转录和 PCR 反应试剂(日本 TaKaRa 公司)。9600PCR 扩增仪(美国PE公司)。

1.2方法

1.2.1分组及模型的建立 36只大鼠随机分为西罗莫司组(Sir组)及单侧输尿管结扎组(UUO组)，同时建立假手术组(Sham组)，每组各12只，每组再随机分为7 d、14 d两亚组。Sham组开腹后，分离左侧输尿管并结扎，随后关闭腹腔，将皮肤进行缝合。UUO组和Sir组8%水合氯醛腹腔注射麻醉后均进行左侧输尿管结扎:在左肋腰点处取一长3 cm的手术切口，逐层切开，暴露左肾，肾蒂，找到输尿管，结扎左侧输尿管随后缝合。Sir组于建模后，给予西罗莫司[2 mg/(kg·d)]灌胃，同时Sham组和UUO组给予同量的生理盐水灌胃，直至实验结束。

1.2.2取材 8%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，将大鼠处死，取出左肾并除去结缔组织和包膜。将血迹洗净并沥干，迅速置于液氮中过夜，并在第2天转移至-80℃冰箱中保存，备用。

1.2.3肾组织病理形态学观察 将取出的肾组织经10%甲醛溶液固定，包埋，连续切片，厚度约3 μm，行 HE 染色。

1.2.4大鼠肾组织TGF-β1免疫组化 采用免疫组化SP法。取大鼠肾组织标本，经4% 多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚切片。切片常规脱蜡、水化，于3%过氧化氢溶液室温放置15 min，水洗，PBS冲洗浸泡2 min，置于枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中微波加热修复，H2O2封闭，滴加适量稀释的TGF-β1多克隆抗体，37℃ 2 h，PBS冲洗8 min×3次，加入二抗(1∶200)，37℃孵育1 h，PBS 冲洗8 min×3次，DAB显色37℃ 20 min，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察。以 PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性反应切片作为阳性对照。TGF-β1阳性染色呈棕色。随机选取3张免疫组化切片,每张取5个高倍镜视野，统计每个视野阳性细胞数，计算平均值就是阳性细胞所占百分比。

1.2.5RT-PCR 检测梗阻侧肾组织中结缔组织生长因子(TGF-β1)mRNA 表达水平 分别取各组大鼠肾组织100 mg，对所有样本进行总RNA提取，并测定浓度，按逆转录试剂盒说明书提取各样本逆转录合成cDNA模板，取2 μl cDNA用于RT-PCR反应。β-actin作为内参，正向引物:5′-CACTGGTCGGGAGTCAGAAC-3′；反向引物:5′-ACAGAACAATA-GGCACAAACG-3′；TGF-β1正向引物:5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′；反向引物:5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′。RT-PCR 反应条件:预变性 94℃ 30 s，变性 94℃ 5 s，退火 60℃，40个循环，独立实验重复3次。取扩增产物5 μl，置1.2%琼脂糖凝胶中(0.5 g/ml溴化乙锭)，将电压调至80 V，电泳30 min，凝胶成像，扫描分析，计算目的基因光密度与β-actin光密度比值。

1.2.6免疫印迹分析 经BCA法蛋白定量后上样，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质:制备 5%浓缩胶及 12%的分离胶。电泳:调解电压至80 V，90 min 后转为100 V至溴酚蓝跑至距分离胶底部0.5 cm 时停止。转膜:280 mA 恒流1 h，结束后关闭电源取出PVDF膜，在丽春红染液中浸泡10 min，如有条带显现说明转膜成功，采用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭1.5 h。加一抗，4℃冰箱过夜。加二抗37℃ 2 h，结束后用TBST漂洗10 min×3次后显影。用 Quantity One软件对蛋白质条带进行分析，测定目的蛋白及β-actin的吸光度并计算目的蛋白的相对表达强度。计算公式如下:相对表达强度=A目的蛋白/Aβ-actin(A表示吸光度值)。

2 结果

2.1病理组织学观察结果 HE染色结果显示:7 d 和 14 d Sham组大鼠肾脏结构未见明显损伤，染色均匀，炎性细胞无浸润，肾小管无扩张，肾小球及肾小管胞体轮廓正常且清晰，亦可见胞核及核仁。7 d UUO组可见淋巴细胞、单核细胞及少量浆细胞浸润，肾乳头出现萎缩，肾间质出现水肿情况，肾小管灶性萎缩，结构紊乱，明显扩张导致间质区变宽，部分肾小管上皮细胞空泡变性或出现坏死脱落，肾小球未见明显病变，其结构正常，内皮细胞清晰可见。14 d UUO组与7 d UUO组比较肾脏结构的破坏进一步加剧。Sir组与UUO组比较，炎性细胞浸润减少，肾小管扩张减轻，肾小管细胞空泡变性减少；14 d Sir组与 7 d Sir组比较病变有所减轻。见图 1。

2.2各组大鼠肾组织TGF-β1 免疫组化结果 免疫组化结果显示，7 d 和 14 d 时UUO组大鼠肾组织 TGF-β1 的阳性细胞数均较同时间点Sham组明显增高(P<0.05)；西罗莫司治疗后，7 d 和14 d 时TGF-β1 的阳性细胞数均较同时间点模型组减少(P<0.05)；Sir组14 d与 7 d 相比较 TGF-β1 的阳性细胞数减少(P<0.05)。见图2及表1。

2.3TGF-β1 mRNA 相对表达量 RT-PCR 结果显示，行单侧输尿管结扎术后7 d及14 d，UUO组大鼠 TGF-β1 mRNA表达量与Sham组相比有明显差异(P<0.05)，随着梗阻时间越长，表达量越高；与相同时间点的UUO组比较，Sir组7 d和14 d的表达差异有统计学意义(P<0.05)。见表2和图3。

图1 病理组织学观察(×400)Fig.1 Histopathological observation(×400)Note: A,B,C were all 7 days;D,E,F were all 14 days.

图2 TGF-β1免疫组化观察(×400)Fig.2 TGF-β1 immunohistochemical observation(×400)Note: A,B,C were all 7 days;D,E,F were all 14 days.

2.4西罗莫司抑制梗阻性肾病大鼠TβR-Ⅰ和α-SMA蛋白的表达 大鼠肾组织中TβR-Ⅰ和α-SMA的表达:UUO组大鼠(14 d)较Sham组均明显升高(P<0.01)，Sir组(14 d)大鼠较UUO组(14 d)均明显降低(P<0.05)。见图4。

Groupsn7 d14 dtPSham group616.9±1.216.1±2.12.9410.052UUO group648.7±3.31)35.8±2.811)14.224<0.001Sir group633.4±2.11)2)24.3±3.21)2)3)8.902 7<0.001

Note：Compared with Sham group,1)P<0.05; compared with UUO group,2)P<0.05; compared with Sir group, 3)P<0.05.

表2 肾组织TGF-β1 mRNA表达变化

Tab.2 Changes of TGF-β1 mRNA expression in renal tissue

GroupsTGF-β1 mRNA7 d14 dSham group0.33±0.050.34±0.08UUO group1.14±0.071)1.36±0.091)Sir group0.71±0.052)0.62±0.102)

Note：Compared with Sham group,1)P<0.05; compared with UUO group at the same time point, 2)P<0.05.

图4 西罗莫司对TβR-Ⅰ和α-SMA蛋白表达的影响Fig.4 Effect of Sirolimus on TβR-Ⅰ and α-SMA protein expressionNote: 1.Sham group;2.UUO group(14 d);3.Sir group(14 d);compared with the Sham group,**.P<0.01;compared with the UUO group,#.P< 0.05.

3 讨论

肾间质纤维化的发生发展过程较复杂，涉及肾小管上皮及间质的损伤、炎性细胞浸润、生长因子分泌增多、纤维母细胞增殖和球后小管周围血管闭塞等。肾脏纤维化的治疗一直是临床上的难点[5]，现有的内科治疗在逆转肾脏纤维化的进展方面尚无效，目前也没有有效的药物或治疗措施来防止肾间质成纤维细胞的活化。本研究发现西罗莫司(Sir)治疗后，UUO大鼠出现肾小管扩张程度减轻、肾小管细胞空泡变性减少、肾乳头萎缩情况好转、肾脏肿大程度也相应减轻及炎性细胞的浸润减少等，这些症状的变化均能反映出Sir对肾脏的保护作用，说明Sir能显著延缓UUO所致的大鼠肾纤维化的进展。

大鼠UUO模型是肾间质纤维化最常用的动物模型[6]。本实验显示，小管损伤的原因是长时间的梗阻现象，而损伤的结果则是肾间质的纤维化。UUO大鼠HE染色结果显示炎性细胞(淋巴细胞、单核细胞及少量浆细胞)浸润，肾乳头出现萎缩，肾间质出现水肿情况，肾小管灶性萎缩，结构紊乱，明显扩张导致间质区变宽，部分肾小管上皮细胞空泡变性或出现坏死脱落，而肾小管上皮细胞损伤后，水重吸收紊乱，肾小球滤过率降低，肾脏肿胀，从而肾小管局部形成一个压力增加-肾小管损伤的恶性循环，多个因素相互促进加重肾纤维化的程度。

Sir是一种新型的大环内酯抗生素类强免疫抑制剂[7]，它能与具有相同免疫亲和蛋白的FK结合形成复合物，其复合物不能与钙调素结合，但能与西罗莫司靶分子(mTOR)结合，激活mTOR抑制多种细胞因子，从而阻止细胞从G1期发展至S期，发挥其免疫作用。最新研究已明确Sir具有抗细胞增殖和抑制免疫的作用[8，9]，通过对肾间质纤维化本质的探讨，有研究认为Sir抑制免疫炎症反应的作用可应用于RIF的治疗[10]。据报道随访4 年后发现，西罗莫司组的肾移植存活率高于环孢素组(77.3% vs 55.2%)，而肾小球滤过率在 30、36、42、48 个月时均明显高于环孢素组(均P<0.05)[11]；临床研究还显示，与环孢素组相比，西罗莫司组的肾移植生存率高、移植功能更好[12]。

TGF-β超家族由一类结构、功能相关的多肽生长因子亚家族组成，目前认为该家族能调节细胞生长及分化，TGF-β1是TGF-β超家族的一员，是作用最强的致肾纤维化细胞因子，能够介导多种信号参与肾间质纤维化的发生发展，从而成为促进肾间质纤维化进程的关键因子，TGF-β1主要依赖于TGF-β超家族信号蛋白Smad 蛋白家族介导其信号传递，先后结合 TβR-Ⅱ和TβR-Ⅰ，形成具有激酶活性的四聚体复合物，激活的TβR-Ⅰ激活酶磷酸化其下游因子 Smad2、Smad3，使Smad2、Smad3 与 Smad4 形成复合物，介导TGF-β信号从胞质传入胞核中[13-15]，从而特异性调节相关的纤维化靶基因的表达，如α-SMA的表达[13，16]，而西罗莫司通过与 mTOR 结合，对活化T和B细胞的生长因子和细胞因子进行抑制，成为肾间质纤维化发展过程中的“阻断剂”[17,18]。在肾间质纤维化时，约36%的肌成纤维细胞(MyoFb)由小管上皮细胞转分化而来，α-SMA作为血管平滑肌细胞的主要成分，是MyoFb激活的特异性标志蛋白。α-SMA在正常肾小球和肾小管细胞中几乎不表达，而向成肌纤维细胞转分化时出现表达。有研究表明肾间质 α-SMA 表达增多会促进肾间质纤维化的发生。本实验中，UUO组7 d、14 d 大鼠，肾组织TGF-β1蛋白和mRNA表达水平增加，同时Western blot检测α-SMA 蛋白表达量也明显增加，这提示左肾组织损伤。而Sir组7 d、14 d较相同时间点的UUO组比较，TGF-β1蛋白和mRNA的表达均减少，差异均具有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示:UUO组肾组织中的TβR-Ⅰ和α-SMA表达水平较Sham组大鼠明显升高(P<0.01)，而较Sir组明显降低(P<0.05)。这提示Sir可能通过抑制和干扰TGF-β1的表达，减少α-SMA的表达，降低肾间质MyoFb的数量从而延缓肾间质纤维化的进展。

综上，本研究证实Sir治疗能够缓解UUO大鼠肾小管局部压力的增加，减少炎症细胞的浸润，进而保护肾小管细胞、减轻肾纤维化。同时我们认为Sir抗纤维化的机制可能与抑制mTOR/TGF-β1-Smad信号传导系统通道的表达有关，但其明确的作用机制仍需进一步深入研究证实。