SPOCK1在大肠癌组织中表达的研究

毕丹丹 成秉林 李宝华 陈晓宇 张淑君

大肠癌(colorectal cancer，CRC)的发生率在恶性肿瘤中高居第3位，大肠癌患者死亡人数占所有恶性肿瘤死亡人数的8%左右，早期发现大肠癌的患者只占所有大肠癌总患病人数不到1%[1]。目前手术是结直肠癌的主要治疗手段，手术切除后的5年生存率平均可达40%～60%，然而术后的局部复发、远处的转移却成了大肠癌患者死亡的最主要原因[2]。因此，提高大肠癌预后效果的关键在于如何尽早发现、诊断大肠癌并对其开展规范化的手术治疗。

细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是一种非细胞成分，存在于组织和器官中，蛋白多糖和纤维蛋白是其主要的两种分子成分。ECM中的大分子被肽酶分解，使其不断地处于动态的重塑状态，保持组织的分化和稳态。肽酶的异常改变以及ECM的分解与合成之间平衡的破坏，都可以使ECM的动态平衡发生明显的改变，进而导致肿瘤的发生。SPOCK1是一种由细胞产生并分泌到细胞间质中的ECM蛋白多糖，直接参与ECM的构成，同时也是新发现的钙离子结合蛋白多糖家族成员之一，对ECM的合成及积累起到了重要的调节作用，同时也可抑制肽酶的活性。近年来，因其具有促进肿瘤形成、抑制肿瘤凋亡、促进肿瘤侵袭和转移、调节ECM重构等生物学作用而备受关注与研究。

材料与方法

1.标本来源:收集2014年7月1日～2015年5月31日哈尔滨医科大学附属第四医院普外科手术切除的19例新鲜大肠癌组织及癌旁组织标本，每例标本取2块，将其中一块标本迅速放于-80℃冰箱中冻存，用于实时荧光定量PCR检测SPOCK1 mRNA；将另一块标本制成相应的石蜡标本。连同收集2007年7月1日～2012年2月28日病理科库存的大肠癌及其癌旁石蜡标本35例，共54例石蜡标本切片进行免疫组化。54例患者均出生于黑龙江省，其中男性33例(61.1%)，女性21例(38.9%)；患者年龄<60岁23例(42.6%)，患者年龄≥60岁31例(57.4%)；结肠癌41例(75.9%)，直肠癌13例(24.1%)；肿瘤直径<5cm 39例(72.2%)，肿瘤直径≥5cm 15例(27.8%)；大体类型为溃疡型42例(77.8%)，隆起型10例(18.5%)，平坦型2例(3.7%)；组织学分级为低分化13例(24.1%)，中分化35例(64.8%)，高分化6例(11.1%)；有淋巴结转移20例(37.0%)，无淋巴结转移34例(63.0%)。所有患者均为首次发现，未接受过放疗和化疗，并且由资深病理医生进行病理诊断和分级，实验中标本均设相应的癌旁组织为对照。

2.主要试剂与仪器：主要试剂中Trizol购自上海TaKaRa公司，反转录试剂盒购自康为世纪公司，实时荧光定量PCR 试剂盒购自康为世纪公司，SPOCK1、GAPDH上下游引物由上海生工工程公司合成，兔抗人多克隆抗体SPOCK1购自武汉三鹰生物技术公司，抗兔二抗购自北京中杉金桥公司，DAB浓缩显色液购自北京中杉金桥公司。主要仪器中real-time-PCR仪产自上海罗氏制药有限公司，低温高速离心机产自德国Eppendorf公司，超净工作台产自美国Thermo公司，制冰机产自日本Sanyo公司。

3.SPOCK1 mRNA表达:采用实时荧光定量PCR方法检测大肠癌中SPOCK1 mRNA的表达。用Trizol分别提取19例新鲜组织标本中的总RNA，并反转录为cDNA。SPOCK1上游引物：5′-CAACTGCTTGTTCCCAGAGG-3′，下游引物：5′-GCCAATGACTTCCC TATCCA-3′，产物长度109bp；GAPDH 上游引物：5′-CAGGAGGCATTGCTG ATGAT-3′，下游引物：5′-GAAGGCTGGGGCTCAT TT-3′，产物长度为138bp。根据Ultra SYBR Mixture试剂盒操作说明书加样：加入2×Ultra SYBR Mixture为1×10-5L；加入上游引物，10μmol/L为5×10-7L；加入下游引物，10μmol/L 为5×10-7L ；加入Template DNA 为8×10-7L；加入RNase-Free Water 为8.2×10-6L。反应体系为20μl，35～40个循环，预变性95℃ 10min；变性95℃ 15s；退火/延伸 60℃ 1min；溶解曲线分析95℃ 15s、60℃ 1min、95℃ 15s、60℃ 15s。采用2-△△Ct分析法，Ct值是每个反应管里的荧光信号达到所设定域值经历的循环数，按照公式计算，扩增的GAPDH作为内参，将每个分组都设为3个复孔。△Ct=Ct平均值(目的基因)-Ct平均值(内参)；△△Ct=△Ct实验组-△Ct空白对照组。

4.免疫组织化学检测SPOCK1蛋白表达:54例大肠癌石蜡标本采用免疫组织化学SP法检测大肠癌SPOCK1蛋白的表达。标本经中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，制成4μm组织切片。经脱蜡、梯度水化后采用柠檬酸高温高压修复4min，放至室温。在3%H2O2中常温孵育0.5h，目的是将内源性过氧化物酶的活性消除。非特异性抗原被山羊血清封闭0.5h之后，滴入1∶100比例的兔抗人多克隆抗体SPOCK1，放入4℃湿盒中过夜。用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3min×3次。在抗兔二抗工作液37℃中孵育0.5h，用PBS溶液冲洗3min×3次。最后用DAB进行显色、苏木素进行复染、中性树胶进行封片。

5.免疫组化结果判定标准:SPOCK1表达阳性的染色反应呈现棕黄色，随机抽取5个高倍镜视野。A：计算阳性细胞占肿瘤细胞的百分比，阴性计0分，0～10%计1分，11%～50%计2分，51%～80%计3分，80%～100%计4分。B：按高比例阳性表达细胞所呈现染色强度进行计分，阴性的计0分，弱阳性的计1分，阳性的计2分，强阳性的计3分。根据阳性表达的细胞数和着色的强度得出综合性的判断，两者相乘计分，乘积结果分别为0、1、2、3、4、6、9、12分，其中0～2分计为SPCOK1蛋白阴性表达，≥3分计为SPOCK1蛋白阳性表达。

结 果

1.SPOCK1 mRNA表达:SPOCK1 mRNA在大肠癌组织中表达明显上调，与癌旁组织比较，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图1。

图1 SPOCK1 mRNA在大肠癌与癌旁组织中的表达

2.SPOCK1蛋白表达：SPOCK1属于分泌型蛋白，其分泌到细胞间质中参与ECM的构成，主要表达于胞质， 阳性染色为棕黄色，呈颗粒状(图2)。54例大肠癌标本中SPOCK1蛋白的表达水平显著升高，与正常组织中的表达比较，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。并且SPOCK1的阳性表达和大肠癌组织学分级呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05)；而与年龄、性别肿瘤部位、肿瘤直径、大体类型、淋巴结转移、浸润深度、远处转移无关，差异无统计学意义(P>0.05,表1)。

图2 SPOCK1免疫组化染色A.SPOCK1在大肠癌组织中表达(×100)；B.SPOCK1在大肠癌组织中的表达(×400)；C.SPOCK1在癌旁组织中表达(×100)；D.SPOCK1在癌旁组织中表达(×400)

图3 SPOCK1蛋白在大肠癌与癌旁组织中的表达

表1 SPOCK1阳性着色和临床病理学资料关系

临床病理特征nSPOCK1阳性表达χ2P年龄(岁) <6023210.647>0.05 ≥603126性别 男性33272.048>0.05 女性2120肿瘤部位 结肠癌41350.422>0.05 直肠癌1312肿瘤直径(cm) <539340.003>0.05 ≥51513大体类型 溃疡型4237 隆起型1092.201>0.05 平坦型21组织学分级 低分化1313 中分化353329.9<0.05 高分化61淋巴结转移 有20191.785>0.05 无3428浸润深度 浆膜/浆膜外48432.483>0.05 未穿透浆膜64远处转移 有870.002>0.05 无4640

3.SPOCK1蛋白的表达与大肠癌临床病理学参数的关系：SPOCK1表达阳性率在低分化大肠癌组织中为100%(13/13)，在中分化组织中为94.3%(33/35)，在高分化组织中为16.7%(1/6)，差异有统计学意义(χ2=29.9，P<0.05)，详见表1。

讨 论

许多恶性肿瘤患者术后无法达到很好的预后效果，甚至出现死亡的原因是肿瘤细胞具有转移和侵袭能力。肿瘤细胞的侵袭和转移会经历以下几个步骤：肿瘤细胞之间黏附性改变，使原发灶脱落，脱落的肿瘤细胞分泌酶降解并穿过ECM屏障，侵入淋巴管和血管，并随着血流在周围组织或远端器官中建立新的肿瘤细胞集落[3]。因此在肿瘤侵袭和转移过程中，ECM屏障被降解是重要步骤，只有ECM屏障被降解，肿瘤细胞才能侵入血管，随着血流转移到其他器官[4]。

SPOCK1是一种ECM蛋白多糖，SPOCK1蛋白的发现是研究者提取睾丸精液中94000的蛋白多糖，为了检测其主要成分，却无意中发现了一个序列，命名为testican，而后改名为SPOCK1。编码此蛋白的SPOCK1基因定位于人染色体5q31区域，含硫酸软骨素链及硫酸乙酰肝素链，其mRNA 长度为5kb，包含12 个外显子，开放阅读框架长1.3kb， 3′端非编码区长达3.3kb，约为其他基因非编码区的4倍，并编码SPOCK1蛋白的439个氨基酸残基。SPOCK1的同源基因为SPOCK1，含有6个功能区域，部分区域能抑制蛋白酶活性。研究表明其第3号外显子可以被选择性地分解，从而发挥特定的靶向功能。SPOCK1同时又属于钙离子结合蛋白多糖家族的成员，共同特点是有着相似的N端、C端和含有卵泡素样结构的区域，并参与细胞的增殖、黏附及转移。蛋白多糖家族除了SPOCK1之外还包括SPARC、testican-2及testican-3。

近期研究发现，SPOCK1不仅在食管鳞状细胞癌、胆囊癌、肝癌、肺癌及胰腺癌中有高表达，而且其表达的程度也与肿瘤的组织学分级、淋巴结转移及患者的短期存活时间有明显的相关性。特别要强调的是，经统计学分析证实，SPOCK1不仅可以作为胆囊癌患者的一个预后指标，也可以对胰腺癌和肝癌的预后起到一定的参考价值[5,6]。研究发现，SPOCK1在前列腺癌中表达量较高,特别在已经出现转移的情况下癌组织SPOCK1表达量更高；同时研究发现SPOCK1能促进前列腺癌的增殖，抑制其凋亡，在胶质母细胞瘤、肝癌、尿路上皮癌、卵巢癌的侵袭和转移中也能发挥一定的促进作用[7～13]。此外，研究表明SPOCK1的高表达会影响胰腺癌及乳腺癌的预后[14～16]。

本研究通过荧光定量PCR检测到SPOCK1基因在癌变组织中的表达明显高于正常组织中，同时应用IHC检测到大肠癌中SPOCK1蛋白也同样高表达，表明SPOCK1也许能促进大肠癌的发生、发展。经进一步研究发现，SPOCK1明显和大肠癌的组织学分级呈正相关。虽然在研究SPOCK1与大肠癌患者临床特征中，SPOCK1和淋巴结转移相关性不明显(P=0.915)，但是考虑到纳入研究的标本量有限，提高研究的标本量或许能有新的发现。SPOCK1作为分泌型蛋白，可以在组织中被灵敏的检测出来，SPOCK1或许可以作为大肠癌早期检测的生物学标志物。笔者下一步重点要研究SPOCK1在大肠癌中是如何发挥促进肿瘤形成、抑制肿瘤凋亡作用的。