响应面法优化民族药地板藤总黄酮提取工艺及其体外抗EV71病毒研究

张 洪 朱 雪 王 帅 李 菁 马大龙 张晓平

桑科榕属植物地果(Ficus tikoua Bur.)为多年生匍匐木质落叶藤本，又名地石榴、地瓜藤、地枇杷等，全株有白色的乳汁，主要分布于我国云南、贵州、广西、湖北、甘肃等地。藤茎入药为地板藤，始载于《滇南本草》，其味苦，性寒，有清热利湿、活血通络、解毒消肿之疗效，主治小儿消化不良、急性胃肠炎、痢疾、黄疸、风湿痹痛、带下、跌打损伤，是彝、苗、壮、傣、哈尼等民族广泛使用的民族药，资源丰富，药用价值高[1,2]。本品《中国药典》2015版未收载，《云南省中药材标准(第1册2005版)》有收载。地板藤主要含有黄酮类、三萜类、甾体类、香豆素类、有机酸类等化合物[3～9]。

本试验在前期研究的基础上，以乙醇为提取溶剂，以提取温度、提取时间、乙醇浓度、料液比为考察因素进行单因素试验，采用Box-Benhnken响应面法优化地板藤总黄酮的提取工艺并探究最优提取条件下地板藤总黄酮的抗病毒作用，为地板藤药材的进一步开发提供理论基础[10～16]。

材料与方法

1.材料：地板藤药材(云南省昆明市新螺蛳湾中药材国际商贸城，批号：20160523)经云南中医学院药用植物学杨耀文教授鉴定为桑科植物地果Ficus tikoua Bur.的干燥藤茎(粉碎，过40目筛，备用)；肠道病毒71型(EV71)；横纹肌瘤细胞(RD)； NaNO2(上海沪试化工有限公司,批号20150708)；Al(NO3)3(天津市大茂化学试剂厂,批号20160103)；NaOH(上海沪试化工有限公司,批号20171110)；培养基(美国Gibco公司，批号8118120)；PBS磷酸盐缓冲液(美国Gibco公司，批号8116531)；MTT(美国VWR LifeScience公司，批号1636C097)；0.25%Trypsin-EDTA(美国Gibco公司，批号1869505)。

2.仪器：酶标仪(Epoch 2微孔板分光光度计，美国Bio Tek公司)；离心机(TDD5M台式多管自动平衡离心机)；水浴加热锅(DZKW-S-6型，北京永光明医疗仪器厂)；4℃冰箱(BCD-278TAJ型，海尔公司产品)；-80℃冰箱(DW-86L286型，海尔公司产品)。

3.醇提法提取地板藤总黄酮：精确称药材粉末5g，乙醇回流提取后，浓缩，乙醇溶液定容于100ml容量瓶中，摇匀待用。

4.芦丁标准曲线的制备：精密量取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6ml，分别置于25ml量瓶中，各加30%乙醇至6.0ml，加5%NaNO2溶液1ml，混匀，静置6min，加10%Al(NO3)3溶液1ml，摇匀，静置6min，加NaOH试液10ml，再加30%乙醇至刻度，摇匀，静置15min，以相应试剂为空白，在500nm紫外波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

6.Box-Benhnken响应面法优化地板藤总黄酮提取工艺：使用依据Box-Benhnken中心组合设计原理，在单因素试验的基础上进行3因素3水平的响应面分析试验，选取影响地板藤总黄酮得率较大的3个因素(料液比、提取时间、乙醇浓度)为自变量，以总黄酮得率(%)为响应值，采用 Design-Expert V11.1.0.1软件对数据进行多项式拟合回归，进一步进行响应面优化设计。

7.病毒的准备：取200μl EV71病毒毒株接种至长成的单层RD细胞上，吸附30min后，加入10ml 2% DMEM维持液后，在37℃、5%CO2病毒培养箱中培养，同时设置细胞对照，当90%以上的细胞出现病变时，反复冻融3次，并吹打离心(1000r/min，20min)，定量分装上清液，待用。

9.Reed-Meuench公式法计算药物毒性：将试验药物用2%DMEM维持也稀释10个浓度梯度，接种于已经长成单层的RD细胞的96孔板中，设4个复孔、细胞对照孔和空白对照孔，置37℃、5% CO2病毒培养箱中进行培养，倒置显微镜逐日观察，当细胞出现90%以上病变时终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h，吸去孔内上清液。每孔加入150μl二甲基亚砜，待沉淀结晶完全溶解后，酶标仪490nm波长下检测吸光度A值，计算TC50。TC50=[Antilog (log高于50%CPE百分率病毒稀释度+比距)]×C。

10.MTT法进行地板藤总黄酮抗病毒试验：在已长成单层的RD细胞中自无毒浓度起每孔加入100ml供试品，供试品用2% DMEM培养液二倍比系列稀释并设置10个浓度梯度，每孔再加入100μl 100倍TCID50的病毒液，同时设病毒对照组及空白细胞对照组，每组4个复孔，置37℃、5% CO2病毒培养箱中进行培养，48h后终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h，吸去孔内上清液。每孔加入150μl二甲基亚砜，待沉淀结晶完全溶解后，酶标仪490nm波长下检测吸光度A值，计算药物半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。EC50=[Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀释度的值-比距)]×C;治疗指数(TI)=半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(EC50)。

结 果

1.单因素考察试验结果：在单因素试验中，对于提取时间的单因素试验结果见图1，当提取时间为0.5h时，地板藤中总黄酮得率为0.3405mg/ml，当提取时间达到1.0h时总黄酮得率达到最大，为0.3507mg/ml，0.5～1.0h，地板藤中总黄酮得率随着提取时间的增长而逐渐增大；当提取时间达到1.5h，总黄酮得率最低，为0.2518mg/ml，之后随时间延长增加至0.2950mg/ml，但得率整体下降。因此，选择0.5、1.0、1.5h 3个提取时间水平进行优化。对于乙醇浓度的单因素试验结果见图2，当乙醇浓度为40%～60%，随着乙醇浓度的增加地板藤中总黄酮得率自0.2452mg/ml逐渐增大；当乙醇浓度为60%时总黄酮得率最大，为0.3333mg/ml；乙醇浓度大于60%后，总黄酮得率随乙醇浓度增大而逐步下降至0.2933mg/ml。因此，选择50%、60%、70% 3个乙醇浓度水平进行优化。

图1 提取时间对得率的影响

图2 乙醇浓度对得率的影响

对于料液比的单因素试验结果见图3，随料液比的增加地板藤中总黄酮得率由0.1994mg/ml逐渐增加至0.3517mg/ml。综合考虑到节约人力、资源等因素，选择1∶20、1∶30、1∶40g/ml 3个料液比水平进行优化。对于提取温度的单因素试验结果见图4，提取温度为50℃时，地板藤中总黄酮得率最高，为0.3245mg/ml。综合4个单因素试验，提取温度对总黄酮得率的影响较小，因此不对提取温度因素进行优化，仅选择50℃作为提取温度的条件使用。

图3 料液比对得率的影响

图4 提取温度对得率的影响

表1 响应面实验设计及结果

表2 方差分析

图5 各因素交互作用对地板藤中总黄酮得率的影响

3.验证性试验结果：根据优选得到的最佳工艺参数进行验证试验，分别称取样品粉末10g，各5份，测定其总黄酮得率所得率为1.1687%(RSD=0.93%，n=5)，说明该回归方程对总黄酮得率的预测准确率高，所优化的总黄酮工艺重复性及可操作性均较好。

4.体外抗病毒试验结果：在病毒的毒力测定试验中，测得TCID50值为10-4.42；在药物的毒性测定试验中，测得TC50值为0.789；在总黄酮的药物毒性试验中测得EC50值为0.084，计算得治疗指数TI值为9.39。表明地板藤总黄酮在体外表现出了较好的抗EV71病毒作用。

讨 论

响应面优化法(RSM)是一种综合试验设计和数学建模的优化方法，有着试验精度高、次数少、数学模型预测性好等优势，且对试验每个水平均可进行连续分析，克服了正交试验只能对某一独立点进行分析的缺点。响应面优化法主要有Doehlert(DM)、星点设计(CCD)与Box-Behnken(BBD)3种常用的实验设计方法。

本实验采用Box-Behnken响应面优化法，对地板藤总黄酮的提取工艺进行优化。首先通过单因素考察，发现提取温度、提取时间、乙醇浓度、料液比4个因素对醇提总黄酮得率均有不同程度的影响，后以对总黄酮得率作用较显著的3个因素作为优化条件，采用响应面优化法对提取工艺进行优化，确定地板藤中总黄酮的最佳提取工艺条件为料液比1∶40，提取时间1.5h，乙醇浓度55.4249%，此时总黄酮得率最高，达到1.169%，该提取方法经济可行，可进一步开发用于工业化生产。地板藤总黄酮表现出较好的抗EV71病毒效果，后续加强研究地板藤中总黄酮对其他病毒的抑制作用并进一步分离纯化，以期找到其发挥作用的主要有效成分，为地板藤资源的开发利用奠定良好的基础。

(致谢：本研究在山东中医药大学创新训练平台上完成，项目号2018057，特此感谢)