厄贝沙坦对肾缺血再灌注损伤小鼠氧化应激的影响

郑丹丹 黄 倩 梁青龙 陈慧勤 王梅爱 黄秋虹 陈泓臻 张华华

血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)在缺血性脏器损伤的发生、发展中发挥着重要作用，抑制Ang Ⅱ的产生并干扰其作用是缺血性脏器损伤治疗的关键所在[1]。厄贝沙坦是一种新型且长效的Ang Ⅱ受体(AT)拮抗剂，通过选择性的与受体1(AT1)结合而完全阻断Ang Ⅱ的效应。众所周知，厄贝沙坦因降低血压、预防心室重构而被广泛应用于临床。现代药理研究证实其还具有多种生物活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡等[2～5]。近年来发现其对心、脑缺血再灌注损伤有确切的保护作用[6～8]。

肾缺血再灌注损伤(RIRI)是临床常见的病理过程，心脏暂停、休克、呼吸衰竭、肾移植等均可导致RIRI。关于RIRI的发生机制目前尚未完全阐明，有研究证实可能与氧化应激损伤有关[9]。因此，从抗氧化应激损伤角度出发探索药物防治RIRI是一种举措。抗氧化剂是一类能帮助捕获并清除自由基，从而减轻对机体损害的一类物质。现存有很多种类抗氧化剂，如维生素C(Vit C)、脂溶性的维生素E(Vit E)，此外，常见的还有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等。研究发现厄贝沙坦有强效的抗氧化作用，可清除体内活性氧簇(ROS)，但是否对RIRI有效应，目前国内外尚未见相关报道[3]。本研究通过建立RIRI小鼠模型，观察厄贝沙坦对RIRI的保护作用，并初步探讨其作用机制，旨在为临床防治急性肾损伤提供理论依据。

材料与方法

1.仪器：全自动生化分析仪(上海恒盛医疗器械有限公司)；普通电冰箱(中国Haier公司)；超低温冰箱(美国NuAir公司)；Bio-Rad垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司)；多功能酶标仪(美国BioTek公司)；Alpha凝胶成像系统(美国Alpha公司)；智能型全自动荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)等。

2.动物：健康SPF级C57BL/6小鼠40只[购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证：SCXK(沪)2007-0005，使用许可证：SYXK(沪)2007-0005]，均为雄性，8～12周龄，体质量21～26g。购买后标准条件饲养，自由进食饮水，每天交替进行12h光照、12h黑暗。

3.药品与试剂：厄贝沙坦(批号：CAS138402-11-6)购自青岛捷世康生物科技有限公司；脂质氧化(MDA)检测试剂盒(批号：S0131)、Cu,Zn-SOD活性检测试剂盒(WST-8法)(批号：S0103)、CAT活性检测试剂盒(批号：S0051)、辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗(批号：A0216)和彩色预染蛋白marker(批号：P0068)均购自上海碧云天公司；anti-Cu,Zn-SOD(批号：ab13498)、anti-CAT(批号：ab-16731)和anti-β-actin(批号：ab8227)均购自英国Abcam公司。

4.方法：(1) RIRI模型小鼠的制备和动物分组：雄性C57BL/6小鼠40只，适应性饲养1周后随机分成4组，即假手术组、RIRI模型组、厄贝沙坦50mg/kg组和厄贝沙坦100mg/kg组，每组10只。后3组制备RIRI模型，具体操作过程如下：2%的戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内注射麻醉小鼠，腹部正中线做切口，暴露双侧肾蒂，以无创动脉夹夹闭双侧肾蒂，45min后去除动脉夹，缝合切口，24h取出双肾[10]。假手术组小鼠不夹闭双侧肾蒂，其余同RIRI模型组。厄贝沙坦组小鼠在术前24h分别按50mg/kg和100mg/kg灌胃给药[11]，假手术组和RIRI模型组小鼠仅接受等体积0.9%氯化钠注射液，4组均连续给药1周。(2)血清Scr、BUN和MDA含量的测定：各组小鼠再灌24h后分别从下腔静脉取血，血液经离心后收集血清，全自动生化分析仪检测血清Scr和BUN含量；按照试剂盒说明书测定血清MDA含量。(3)肾皮质MDA含量以及Cu,Zn-SOD、CAT活力的测定：各组小鼠处死后，取出一侧肾脏，切取部分皮质进行匀浆，按试剂盒说明书检测肾皮质匀浆中MDA含量以及Cu,Zn-SOD、CAT的活力。(4)肾脏病理组织学检查：各组小鼠再灌24h后，迅速取出另一侧肾脏，置于4%多聚甲醛液中固定，常规脱水、石蜡包埋、切片(约3μm厚)、HE染色，光镜下观察肾组织病理变化。(5)肾皮质中Cu,Zn-SOD和CAT蛋白表达的检测：每组小鼠各取5只，全部处死后取出部分肾皮质，制备肾皮质匀浆，按相应比例(20mg/200μl)加入预冷的组织裂解液，充分裂解后吸取上清，提取肾皮质总蛋白，浓度采用BCA法测定。小鼠肾皮质中Cu,Zn-SOD和CAT蛋白水平采用Western blot法测定。取30μg总蛋白加样于预灌制的聚丙烯酰胺凝胶中，电泳2.5h后电转移至硝酸纤维膜(PVDF)，5%脱脂奶粉室温封闭1h，洗膜后加入anti-Cu,Zn-SOD抗体及anti-CAT抗体，4℃冰箱摇床孵育过夜，洗膜后与HRP标记的二抗混合，室温孵育2h，采用化学发光ECL显影、定影，选用β-actin作为内参照，目的蛋白与β-actin的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量。

结 果

1.厄贝沙坦对小鼠血清中Scr、BUN和MDA含量的影响：与假手术组比较，RIRI模型组小鼠血清Scr、BUN和MDA含量均明显升高(P<0.01)。与RIRI模型组比较，厄贝沙坦50mg/kg组和厄贝沙坦100mg/kg组的Scr、BUN和MDA含量均明显降低(P<0.05)，且厄贝沙坦100mg/kg组小鼠血清中Scr、BUN和MDA含量明显低于厄贝沙坦50mg/kg组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 厄贝沙坦对小鼠血清中Scr、BUN和MDA含量的影响

与假手术组比较,*P<0.01；与RIRI模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与厄贝沙坦50mg/kg组比较,ΔP<0.05

2.厄贝沙坦对小鼠肾皮质中MDA含量以及Cu,Zn-SOD、CAT活力的影响：与假手术组比较，RIRI模型组小鼠肾皮质中MDA含量明显升高(P<0.01)，Cu,Zn-SOD和CAT活力均明显下降(P<0.01)。与RIRI模型组比较，厄贝沙坦50mg/kg组和厄贝沙坦100mg/kg组小鼠肾皮质中MDA含量均明显降低(P<0.05)，Cu,Zn-SOD和CAT活力均明显升高(P<0.05)，且厄贝沙坦100mg/kg组小鼠肾皮质中MDA含量明显低于厄贝沙坦50mg/kg组(P<0.05)，Cu,Zn-SOD和CAT活力明显高于厄贝沙坦50mg/kg组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 厄贝沙坦对小鼠肾皮质中MDA含量以及Cu,Zn-SOD和CAT活力的影响

与假手术组比较,*P<0.01；与RIRI模型组比较,#P<0.05，##P<0.01；与厄贝沙坦50mg/kg组比较,ΔP<0.05

3.肾脏病理组织学改变：光镜下假手术组小鼠肾组织切片中肾小管上皮细胞无明显肿胀，未见明显炎性细胞浸润；RIRI模型组小鼠肾小管上皮细胞肿胀明显，可见不同程度的坏死、脱落，间质充血与炎性细胞浸润。厄贝沙坦50mg/kg组和厄贝沙坦100mg/kg组小鼠肾组织病理性损伤有不同程度缓解，以厄贝沙坦100mg/kg组更为明显。各组小鼠肾脏病理性变化见图1。

图1 各组小鼠肾脏组织切片HE染色图(×200)
A.假手术组；B.RIRI模型组；C.厄贝沙坦50mg/kg组；D.厄贝沙坦100mg/kg组;白色箭头代表肾小管上皮细胞脱落；绿色箭头代表肾间质炎性细胞浸润

4.肾皮质中Cu，Zn-SOD和CAT蛋白水平：与假手术组比较，RIRI模型组小鼠肾皮质中Cu，Zn-SOD和CAT蛋白表达水平均明显降低(P<0.01)；与RIRI模型组比较，厄贝沙坦50mg/kg组和厄贝沙坦100mg/kg组小鼠肾皮质中Cu，Zn-SOD和CAT蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)，且厄贝沙坦厄贝沙坦100mg/kg组较50mg/kg组两蛋白表达更高，差异均有统计学意义(P<0.05)。各组小鼠肾皮质中Cu，Zn-SOD和CAT蛋白表达的电泳图见图2。

讨 论

缺血再灌注损伤可出现在多种脏器中，其中RIRI在临床上十分常见，可使移植肾功能恢复延迟、肾功能恶化，严重者出现多脏器衰竭，甚至导致患者死亡。其发生机制复杂，研究表明，与肾内ROS水平堆积等因素密切相关[9]。因此，减少肾脏内ROS的水平有望减轻RIRI。厄贝沙坦是继氯沙坦之后的又一种新型长效的AT拮抗剂，有临床资料报道，厄贝沙坦对急性肾损伤患者具有很好的疗效，减少了患者外周血中炎性介质的水平，减轻了炎症损伤[11,12]。最新的研究发现其可抗脂质过氧化和清除ROS，可对抗ROS对机体组织、细胞的损伤，对重要脏器缺血再灌注损伤具有确切的保护作用[3,6～8]。

肾脏血流量大，氧供丰富，ROS产生的机会较多，是体内最容易发生氧化应激损伤的脏器之一。研究发现指标MDA在一定程度上能够反映RIRI模型小鼠氧化应激损伤，且损伤程度的高低与肾功能指标Scr和BUN等密切相关[13]。本研究结果显示，RIRI时Scr、BUN和MDA含量均明显升高，进一步支持了上述观点。RIRI过程中产生大量ROS，主要包括超氧阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)，同时机体内源性抗氧化防御系统功能受损，特别是体内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性降低，不能有效清除ROS，导致ROS大量堆积。堆积的ROS能够破坏细胞膜的生物结构和功能，导致细胞功能和能量障碍进而引起一系列病理变化[14～16]。本研究结果中同样发现上述抗氧化酶Cu，Zn-SOD和CAT活性降低，提示模型制备成功，且厄贝沙坦预处理后能够减少RIRI血清和肾皮质中MDA含量，减轻肾脏病理性损伤，并提高肾皮质Cu，Zn-SOD和CAT活性。Wang等[17]在RIRI大鼠模型的肝、肾组织中检测出SOD活性均降低，而薛芳等[18]发现RIRI时肺组织中Cu，Zn-SOD蛋白表达均升高，机体通过上调Cu，Zn-SOD的含量来清除过多ROS，进而保护肺组织免遭过氧化损伤。与此不一致的是，本实验中肾皮质中Cu，Zn-SOD和CAT的蛋白表达均下降，考虑可能与被检测的组织不同有关。厄贝沙坦预处理后肾皮质中Cu,Zn-SOD和CAT的蛋白表达均升高。以上结果表明厄贝沙坦预处理能够减少ROS堆积，提高肾组织抗氧化防御系统功能，减轻肾脏病理性损伤，最终减轻RIRI。

综上所述，厄贝沙坦预处理对小鼠RIRI有保护作用，其作用机制与对抗氧化应激损伤、提高抗氧化防御系统功能有关，但由于厄贝沙坦的作用广泛，而RIRI病理机制复杂，厄贝沙坦抗RIRI的其他机制有待进一步研究。