三种microRNA在胃癌患者中的表达及临床意义①

王文尖 罗 琼 覃世运 陈丽君 马艳华

(海南省第三人民医院放疗科，三亚572000)

胃癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，我国每年胃癌新发人数约占全球胃癌新发人数的40%以上，全球胃癌死亡率在全部恶性肿瘤中居第二位[1]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类可调控转录水平基因表达的小分子非编码RNA，在肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移等多种生物学过程中起着重要的作用[2]。近期的研究表明，miR-16、miR-93及miR-196b在结肠癌、乳腺癌和胰腺癌等患者中的表达与健康人群存在明显不同，可能在恶性肿瘤的诊断、治疗和预后方面扮演重要角色[3-5]。然而，目前血清miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌中表达和淋巴结转移关系的研究较少。本研究通过检测血清miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌患者中的表达情况，分析其诊断胃癌及预测淋巴结转移的价值，旨在为胃癌诊断、预后评估及靶向治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月至2018年3月在海南省第三人民医院做胃镜检查的门诊及住院的胃部疾病患者528例，根据胃镜检查及组织病理学结果将受检者分为胃癌患者116例和非胃癌患者412例。胃癌患者分为早期胃癌44例和进展期胃癌72例，有淋巴结转移68例，无淋巴结转移48例，其中男性71例，女性45例，年龄35～84岁，平均(61.75±11.26)岁。纳入标准：①组织病理类型的判断标准参照WHO胃癌的病理学分类；②术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗者；③未并发其他肿瘤者。排除严重肝肾疾病、内分泌代谢疾病及其他结缔组织病。412例非胃癌患者(包括萎缩性胃炎、非萎缩性胃炎和胃溃疡)男性260例，女性152例，年龄32～81岁，平均(59.84±12.16)岁。另选择50例同期健康体检正常者作为对照组，其中男性30例，女性20例，年龄38～80岁，平均(60.53±9.64)岁。各组性别、年龄等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，并签署患者知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 总 RNA提取 空腹抽取静脉血3 ml置于未加抗凝剂的离心管中，于室温2 500 r/min离心15 min，分2层，吸取上层血清400 μl转移至1个EP管中，加入1 ml提取剂(Trizol)，于-70℃保存。从-70℃冰箱取出上述保存在EP管中的细胞，按照总RNA快速提取试剂盒说明书从中提取总RNA。

1.2.2 引物设计与合成 miR-16引物：上游：5′-ATCAAGCTTATCAGACAAGC-3′，下游：5′-ATGTGCCCGGTCAGAGGC-3′；miR-93引物：上游：5′-ATTC-AGCTAATCAGACTGGC-3′，下游：5′-ATCTGCAAGGTCAGAGTG-3′；miR-196b引物：上游：5′-ATCATCGAGCTGACTACTCG-3′，下游：5′-GCTTGCGCAGAGTAGTAG-3′。

1.2.3 miRNA逆转录及RT-PCR 应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription试剂盒逆转录已定量的RNA，选用U6作为内参，反应体系为15 μl，反应参数为：16℃ 30 min；42℃ 30 min，85℃ 5 min。在ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)。反应体系为20 μl：TaqMan MicroRNA Assay 1.00 μl，cDNA 1.33 μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μl，ddH2O 7.67 μl，混合后离心放入定量 PCR仪。扩增条件为：95℃预热10 min，95℃变性15 s，60℃退火60 s，45个循环，最后38℃延伸5 s，实验重复3次。以U6为内参照，采用2-ΔΔCt法计算miRNA的相对表达水平，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct U6。

2 结果

2.1 各组血清miR-16、miR-93及miR-196b表达水平比较 胃癌组血清miR-16、miR-93及miR-196b表达水平均明显高于非胃癌组和对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。非胃癌组与对照组血清miR-16、miR-93及miR-196b表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 早期胃癌组、进展期胃癌组血清miR-16、miR-93及miR-196b表达水平比较 进展期胃癌组血清miR-16、miR-93及miR-196b表达水平均明显高于早期胃癌组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

2.3 淋巴结转移组和无淋巴结转移组血清miR-16、miR-93及miR-196b表达水平比较 淋巴结转移组血清miR-16、miR-93及miR-196b表达水平均明显高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

2.4 血清miR-16、miR-93及miR-196b对胃癌的诊断价值 血清miR-16、miR-93及miR-196b诊断胃癌的最佳截断值分别为11.83、2.85、2.14。三项联合诊断胃癌的AUC(95%CI)明显高于单项miR-16、miR-93及miR-196b，差异有统计学意义(Z=4.705，6.928，6.314，P<0.05)。miR-16、miR-93及miR-196b中每两个指标的联合检测对胃癌诊断的敏感度和特异度均明显低于三项指标联合检测。见表4、图1。

2.5 血清miR-16、miR-93及miR-196b预测胃癌淋巴结转移的价值 血清miR-16、miR-93及miR-196b预测胃癌淋巴结转移的最佳截断值分别为21.50、6.80、4.36。三项联合预测胃癌淋巴结转移的AUC(95%CI)为0.960(0.905～0.997)明显高于单项miR-16[0.904(0.847～0.960)]、miR-93[0.862(0.806～0.919)]及miR-196b[0.830(0.772～0.891)]，差异有统计学意义(Z=4.637，6.803，7.204，P<0.05)。miR-16、miR-93及miR-196b中每两个指标的联合检测对预测淋巴结转移的敏感度和特异度为(87.5%和82.4%，85.6%和81.6%，84.8%和80.7%)均明显低于三项指标联合检测(94.0%和87.5%)。见表5、图2。

GroupsnmiR-16miR-93miR-196bControl group505.96±1.240.78±0.120.36±0.05Non gastric cancer group4126.12±1.350.90±0.150.41±0.07Gastric cancer group11619.24±6.821)2)5.06±0.831)2)3.85±0.641)2)F14.2769.75310.140P<0.001<0.001<0.001

Note：Vs control group,1)P<0.05；vs non gastric cancer group,2)P<0.05.

GroupsnmiR-16miR-93miR-196bEarly gastric cancer group4413.38±4.503.12±0.632.38±0.35Advanced gastric cancer group7224.70±9.167.85±1.405.30±0.77t12.3059.2037.246P<0.001<0.001<0.001

GroupsnmiR-16miR-93miR-196bNo lymph node metastasis group4812.14±4.202.85±0.602.14±0.30Lymph node metastasis group6826.28±8.508.16±1.545.75±0.93t15.30610.4279.148P<0.001<0.001<0.001

表4 血清miR-16、miR-93及miR-196b对胃癌的诊断价值

Tab.4 Diagnostic value of serum miR-16,miR-93 and miR-196b in gastric cancer

ItemOptimal cut-off valueAUC(95%CI)PSensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictive value(%)Negativepredictive value(%)miR-1611.830.870(0.810-0.932)<0.00185.683.485.883.6miR-932.850.812(0.754-0.873)0.00479.478.376.282.7miR-196b2.140.840(0.782-0.902)<0.00180.682.785.477.5Three combination-0.928(0.873-0.984)<0.00191.584.287.588.6

表5 血清miR-16、miR-93及miR-196b预测胃癌淋巴结转移的价值

Tab.5 Value of serum miR-16,miR-93 and miR-196b in predicting lymph node metastasis of gastric cancer

ItemOptimal cut-off valueAUC(95%CI)PSensitivity(%)Specificity(%)Positive predictivevalue(%)Negative predictivevalue(%)miR-1621.500.904(0.847-0.960)<0.00187.485.088.384.5miR-936.800.862(0.806-0.919)<0.00185.381.279.388.0miR-196b4.360.830(0.772-0.891)<0.00179.581.484.376.7Three combination-0.960(0.905-0.997)<0.00194.087.590.891.2

图1 miR-16、miR-93及miR-196b诊断胃癌的ROC曲线Fig.1 ROC curve of miR-16,miR-93 and miR-196b in diagnosing gastric cancer

图2 miR-16、miR-93及miR-196b预测胃癌患者淋巴结转移的ROC曲线Fig.2 ROC curve of miR-16,miR-93 and miR-196b predict lymph node metastasis in gastric cancer patients

图3 血清miR-16与miR-93、miR-196b的相关性Fig.3 Correlation between serum miR-16 and miR-93，miR-196b

2.6 胃癌患者血清miR-16与miR-93、miR-196b的相关性 Pearson相关分析显示，胃癌患者血清miR-16与miR-93呈正相关(r=0.764，P<0.01)，miR-16与miR-196b呈正相关(r=0.835，P<0.01)，miR-93与miR-196b呈正相关(r=0.707，P<0.01)。见图3。

3 讨论

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率近年来明显升高且呈年轻化趋势，早期胃癌缺乏一定的症状和体征，难以发现，而出现明显的临床症状时，多属于进展期胃癌或伴有远处转移，从而导致患者的死亡率较高、预后较差。因而，胃癌患者早期诊断和预测淋巴结转移对其救治显得尤为重要。胃癌的发生发展和转归是一个多阶段、多因素的连续性过程，其发病机制复杂，涉及蛋白质编码的原癌基因和抑癌基因的遗传学和表观遗传学改变。miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码单链RNA，广泛存在于真核生物中，长度约为20～24个核苷酸，通过在转录后水平调控靶基因的表达参与各种重要的生物学过程，如细胞增殖、分化和凋亡，病毒防御、肿瘤转移、血管形成及免疫应答等[6，7]。有研究表明，miR-16、miR-93及miR-196b在多种恶性肿瘤中异常表达，且不同恶性肿瘤组织miR-16、miR-93及miR-196b的表达水平不同，miR-16、miR-93及miR-196b对恶性肿瘤早期诊断、转移、分期和预后评估等方面具有重要的提示作用[8-10]。本研究显示，胃癌组血清miR-16、miR-93及miR-196b表达水平均明显高于非胃癌组和对照组，而非胃癌组和对照组之间差异无统计学意义。提示miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌患者中异常高表达，可能通过发挥癌基因的作用来调节胃癌的发生发展过程。Liu等[11]研究发现，miRNA在胃癌组织中的表达水平明显高于相应的正常组织，其表达水平越高，淋巴结转移越频繁，进展期越高，miRNA的高表达是影响患者总生存率的独立预后因素。本研究中进展期胃癌组血清miR-16、miR-93及miR-196b表达水平均明显高于早期胃癌组，淋巴结转移组血清miR-16、miR-93及miR-196b表达水平均明显高于无淋巴结转移组，分析原因可能是病情进展期或存在淋巴结转移的患者肿瘤负荷往往较大，肿瘤组织可释放更多的具有原癌基因作用的miRNA进入血液，同时可抑制机体原有的具有抑癌作用的miRNA水平表达，进而导致机体microRNA表达水平异常升高。这提示miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌发生发展过程中发挥着重要的作用，其水平升高可能促进胃癌的病情进展和淋巴结转移。Zhang等[12]研究也显示，miR-16与胃癌临床病理特征相关，未来在胃癌早期筛查和进展评估等应用中具有巨大潜力。Chen等[13]研究发现，miR-93在胃癌，尤其是晚期和转移性胃癌中显著升高，提示miR-93可能在胃癌的发生发展中起重要作用，miR-93高表达可作为胃癌预后不良的新型标志物。另有研究认为，miR-196b表达水平与胃癌患者的临床分期、淋巴结转移及预后密切相关，可能是胃癌新的潜在诊断和预后分子标志物及治疗靶点[14]。由此推测miR-16、miR-93及miR-196b与胃癌发生、发展密切相关，有可能是一类新型标志物，在胃癌的发病机制中发挥关键作用。本研究应用ROC曲线分析，结果显示miR-16、miR-93及miR-196b诊断胃癌的最佳截断值分别为11.83、2.85、2.14，预测胃癌淋巴结转移的最佳截断值分别为21.50、6.80、4.36，三项联合诊断胃癌和预测胃癌淋巴结转移的曲线下面积均最大，其敏感度和特异度均最高。miR-16、miR-93及miR-196b中每两个指标的联合检测对胃癌诊断及预测淋巴结转移的敏感度和特异度均明显低于三项指标联合检测。相关分析显示，胃癌患者血清miR-16与miR-93、miR-196b均呈正相关(r=0.764、0.835，P<0.01)。这说明miR-16、miR-93及miR-196b可作为诊断胃癌发生和淋巴结转移的新型生物标志物，三项联合检测有助于提高胃癌诊断及预测淋巴结转移的准确性。Zhu等[15]研究表明，血清miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451及miR-486-5p表达水平上调与胃癌发生、发展有关，其诊断胃癌的AUC均较好，这五个miRNA可作为检测早期胃癌的潜在非侵入性生物标志物。亦有研究发现，血清miR-93在胃癌患者中明显升高，且在有淋巴结转移患者中升高更显著，有可能作为胃癌早期诊断和预后预测的生物标志物[16]。由此可见，血清miR-16、miR-93及miR-196b检测为胃癌诊断和转移提供了一种非侵入性的方法，在未来有较广阔的应用前景。

综上所述，血清miR-16、miR-93及miR-196b表达水平在胃癌患者中明显上调，且与胃癌发生发展相关，三项联合检测有助于提高胃癌诊断及预测淋巴结转移的准确性，同时也为阐明胃癌癌变的分子机制提供新的线索。但本研究为单中心的临床研究，其结果尚需多中心、大样本的临床对照研究来验证，从而进一步推动miRNA用于胃癌诊断及预后监测。