Ubc13对胶原诱导性关节炎小鼠体内Treg/Th17平衡的影响研究①

任路路 韩 蓉 郭 音 范阔海 姜俊兵

(山西农业大学动物科技学院,太谷030801)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种全身性自身免疫疾病，其特征是进行性的关节软骨破坏和骨吸收，造成关节畸形[1]。RA发病原因目前尚不完全清楚，有研究发现RA患者体内T细胞稳态破坏，CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cells,Treg)细胞数目下降[2]，而辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)细胞数目上升[3]。类风湿性关节炎患者体内的Treg细胞和Th17细胞的失衡可能是RA治疗的潜在靶点之一[4,5]。Treg细胞通过细胞-细胞接触和分泌多种细胞因子如白介素10(Interleukin-10,IL-10)和转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)抑制自身反应性淋巴细胞，预防自身免疫性疾病的发生[6]，Treg细胞中特异性的转录因子是Foxp3，起控制Treg细胞的生长发育与免疫活性的作用[7]，Treg细胞数量减少或者Foxp3表达降低均引发自身免疫性疾病[8]。Treg细胞调控Th17细胞的分化及表型的维持，但类风湿性关节炎患者中Treg细胞与Th17细胞的平衡被破坏，导致Th17细胞过度活化[9]。Th17细胞是自身免疫性疾病中重要的致病性细胞，抑制Th17细胞的分化或IL-17的产生能显著缓解多种自身免疫性疾病[10]。RORγt是Th17细胞的关键转录因子，与白介素23(IL-23)共同作用调控Th17细胞的分化与IL-17的分泌能力[11,12]。在CIA小鼠关节滑膜中，Th17细胞诱导成骨细胞表达核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor-κ B ligand,RANKL)表达，产生破骨细胞导致软骨腐蚀[13]。

胶原诱导性关节炎动物模型是广泛使用的类风湿性关节炎模型。研究证实，外周T细胞对自身胶原的识别导致T细胞稳态被破坏是CIA小鼠发病的主要原因[14]，其中Treg细胞与Th17细胞的平衡被破坏，部分Treg细胞在长期炎症条件下获得Th17细胞表型，相比Th17细胞对关节滑膜造成更严重的损伤[15]。

泛素结合酶2N(Ubiquitin-conjugating enzyme E2 N,Ubc13)通过T细胞受体(TCR)通路调节外周T细胞增殖与活化能力，维持T细胞稳态[16,17]。研究证实在CIA小鼠中Ubc13能维持Treg细胞免疫抑制活性，抑制其获得Th17细胞表型[18]。由此预示Ubc13蛋白对维持CIA小鼠中Treg细胞免疫抑制功能，IL-17、IL-23和RORc等基因的表达，恢复Treg/Th17细胞的平衡，起到一定的治疗效果。

本试验通过CIA小鼠注射鼠源Ubc13重组蛋白研究Ubc13对CIA小鼠体内Treg细胞和Th17细胞数目的影响，以期了解Ubc13对CIA小鼠Treg细胞和Th17细胞平衡的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 重组蛋白Ubc13由山西农业大学临床兽医学试验室提供[19]；牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂(CFA)购自chondrex公司；反转录试剂盒购自TaKaRa公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；2×SYBR Green qPCR Master MIX购自Bimake公司；FITC anti-mouse-CD4 Antibody、PE anti-mouse CD25 Antibody、PE/Cy7 anti-mouse IL-17A Antibody、购自Biolegend公司；Foxp3 Monoclonal Antibody、细胞刺激剂(含蛋白转运抑制剂)、Foxp3转录因子染色套装、胞内因子染色套装购自Bioscience公司；SPF级DBA/1雄性小鼠购自北京维通利华实验动物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 CIA小鼠模型的建立 将40只6周龄DBA/1雄性小鼠，随机分为5组，分别为Ubc13低剂量组、Ubc13中剂量组、Ubc13高剂量组、模型组和空白组。所有小鼠自由进食饮水，适应性喂养1周。将牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂等体积混合，乳化后免疫小鼠，分别对Ubc13低剂量组、Ubc13中剂量组、Ubc13高剂量组和模型组小鼠经尾根部皮下多点注射，100 μl/只；空白组小鼠经尾根部皮下多点注射等量生理盐水。注射21 d后加强免疫。第2次免疫后，Ubc13低剂量组、Ubc13中剂量组和Ubc13高剂量组分别通过皮下注射Ubc13重组蛋白100 μl/只，Ubc13重组蛋白含量分别为(5 μg、25 μg、50 μg)，每天注射1次，连续注射21 d；空白组每天注射一次等体积生理盐水，连续注射21 d；模型组不做任何处理。第2次免疫后，观察小鼠RA发病情况，每周2次记录关节炎评分，连续观察8周后，解剖小鼠。

1.2.2 关节炎评分 关节炎指数评定依据小鼠四肢红肿的程度和范围，0分为无红斑和肿大；1分为踝关节轻微的红肿；2分为整个足爪轻微的红肿；3分为整个足爪中度红肿；4分为整个足爪重度红肿。四肢单独计分，关节炎评分为四肢分数的总和。

1.2.3 关节滑膜组织HE染色 将小鼠双侧后肢自膝关节以上约1 cm处截断，去除皮肤和肌肉，于Bouin′s固定液中固定24 h，后置于pH7.4 13% EDTA在45℃水浴锅中脱钙7 d，每天更换EDTA脱钙液一次。石蜡切片经HE染色，干燥后中性树胶封片，光学显微镜下观察关节滑膜组织形态结构。

1.2.4 脾淋巴细胞分离与刺激 解剖小鼠，无菌取出脾脏，留一小部分冻存，其余部分于超净台中用剪刀剪碎，于200目筛上研磨，收集滤下的细胞，红细胞裂解液处理，收集淋巴细胞，用1 ml含5%血清1640培养基培养3 h，除未刺激对照组外，每孔加入2 μl 淋巴细胞刺激剂和转运抑制剂培养8 h，血细胞计数板计数后，收集1×106个淋巴细胞。

1.2.5 Treg/Th17细胞流式细胞术检测 在100 μl细胞悬液中加入相应的荧光标记抗体(FITC-CD4、PE-CD25)，混匀，室温避光孵育20 min；加入2 ml细胞缓冲液混匀，500 g离心5 min，重复1次。

胞外染色后，于样品中加入1 ml细胞固定液，混匀，室温下避光固定15 min。固定液洗涤1次。加入2 ml破膜buffer，500 g，离心5 min，重复1次。用100 μl破膜缓冲液，轻柔混匀。加入荧光标记抗体(PE/cy7-IL-17a、APC-Foxp3)，室温避光孵育30 min。加入2 ml染色buffer，500 g离心5 min，弃上清，重复1次。加入1 ml染色buffer，轻柔混匀，流式细胞仪(BD Accuri C6 plus)检测分析。

1.2.6 实时荧光定量检测RORc、IL-17、Foxp3和IL-23 mRNA表达 取冻存小鼠脾脏组织研磨，按照Invitrogen Trizol试剂说明书提取脾脏总RNA，用ND-1000(NanDrop Technologies)测定其浓度，凝胶电泳检测其完整性。使用TaKaRa公司反转录试剂盒进行cDNA合成。采用NCBI工具进行特异性引物设计，交由擎科生物公司合成，引物序列见表1。RORγt由RORc编码，RORc、IL-17、IL-23的表达水平表示Th17细胞活化程度，Foxp3表达水平表示Treg细胞活化程度。

使用bimake公司SYBR Green qPCR Mix进行荧光定量PCR。反应体系为:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA ≤100 ng，加水至20 μl。反应条件:95℃预变性5 min;95℃ 10 s,60℃ 10 s,72℃ 20 s,40个循环，72℃ 2 min。GAPDH 作为内参基因，与待检测样品共同扩增，每个样品重复3 次。根据扩增曲线的CT值计算定量结果。通过2-ΔΔCT计算RORc、IL-17、Foxp3和IL-23在对照组和实验组脾脏中的相对表达水平。GAPDH作为内参基因，与RORc、IL-17、Foxp3和IL-23共同扩增，每个样品重复3次。

2 结果

2.1 小鼠CIA模型的鉴定与治疗效果评价 模型组小鼠在第3天左右后足出现红肿，在第7天出现前足红肿，关节炎评分在14～25 d出现高峰，且其病症在模型建立56 d后未见显著减轻。模型组小鼠肿胀关节不能承重，关节活动障碍，皮毛杂乱，提示小鼠CIA模型建立成功。Ubc13处理的各组小鼠关节红肿出现时间与模型组接近。高剂量组关节炎病情在第0～33天内较模型组轻微，但Ubc13低剂量组和中剂量组关节炎评分较模型组无明显差异(P>0.05)。见图1。

表1 本试验所用引物序列

Tab.1 Primer sequences used in experiment

GenePrimer sequenceRORcF:AAGACTGATTTTCTGCCCCTAGR:TCTATCCCATCTACCCCACAGFoxp3F:GGTACACCCAGGAAAGACAGR:ATCCAGGAGATGATCTGCTTGIL-23F:TGCGATCTCTGATGGCTGTCR:GACGATGTATGGCTGCTGGAIL-17F:TACCTCAACCGTTCCACGTCR:TTTCCCTCCGCATTGACACAGAPDHF:GGTTGTCTCCTGCGACTTCAR:GTCAGGTTTCCCATCCCCAC

图1 CIA小鼠关节炎评分表(n=8)Fig.1 CIA mice arthritis score(n=8)Note: Observe the state of the mouse every day,record arthritis score twice a week after second inject collagen，Date are presented as

图2 模型组小鼠与Ubc13处理各组小鼠关节HE染色Fig.2 HE staining of mouse joint in model and Ubc13 treatment miceNote: The hind paw from CIA model and Ubc13 treatment mice were decalcificated,then stain by HE.A.Joint section from the control group mice；B.Joint section from the models group mice；C.Low does Ubc13；D.Medium dose；E.High dose mice joint section；Ac.Articular cartilage；Sm.Synovial membrane；Jc.Joint cavity.

图3 流式细胞术分析脾脏中Treg/Th17细胞的比率 Fig.3 Flow cytometry analysis of Treg cell ratio and Th17 cell ratio in model and Ubc13 treated mice spleensNote: A.FACS plot shows Th17 cells(as reported by CD4-FITC,IL-17A-PE/cy7) among CD4+T cells(CD4+determined by cell surface staining for CD4 protein)；B.Bar graph shows the average percentage of Th17 cells among CD4+Tcell in spleen；C.FACS plot shows Treg cells(as reported by CD25-PE,Foxp3-APC) among CD4+T cells(CD4+determined by cell surface staining for CD4 protein)；D.Bar graph shows the average percentage of Treg cells among CD4+T cell in spleen.For all graphs,date are presented as

图4 实时荧光定量分析对照组与Ubc13处理组脾脏中RORc、IL-23、IL-17、Foxp3 mRNA的表达量Fig.4 qRT-PCR analysis of expression of RORc，IL-23，IL-17，Foxp3 mRNA in spleens samples collected from control and Ubc13 treatment micesNote: By the real-time PCR amplification plots and melt cruve analysis and judgement,the CT values calculated by analyzed through 2-ΔΔCT.A.The mRNA levels of Foxp3 in CIA model and Ubc13 treatment mices；B.The mRNA levels of RORc in CIA model and Ubc13 treatment mices；C.The mRNA levels of IL-17 in CIA model and Ubc13 treatment mices；D.The mRNA levels of IL-23 in CIA model and Ubc13 treatment mices.Date are presented as (n=8)，*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.2 CIA小鼠膝关节组织病理学检查 HE染色结果显示，正常组小鼠关节软骨边缘光滑完整，未见淋巴细胞浸润与软骨缺失；模型组小鼠关节炎滑膜组织重度增生，滑膜层变厚，淋巴细胞浸润，软骨重度缺失；Ubc13处理的各组HE染色显示滑膜增生及淋巴细胞浸润、软骨丢失等较模型组轻。见图2。

2.3 脾脏中Treg细胞和Th17细胞比率 流式细胞术结果显示，与模型组相比，Ubc13各剂量组均能显著提高Th细胞中Treg细胞的比率(P<0.01)，且高剂量组能极显著增加Treg的数目(P<0.001)。与模型组相比，Ubc13处理的各组Th17细胞数目无显著差异，高剂量组Th17细胞比率有下降趋势(P>0.05)。见图3。

2.4 Foxp3、RORc、IL-17、IL-23 mRNA表达水平 Foxp3表达表示Treg细胞分化水平，RORc、IL-17、IL-23表达表示Th17细胞活化水平。实时荧光定量结果显示，Ubc13处理组Foxp3表达量与模型与空白之间无显著差异(P>0.05)，高剂量组有升高趋势。Ubc13处理组各组RORc表达量均低于模型组，其中高剂量组与低剂量组表达量极显著低于模型组(P<0.001)；Ubc13处理组各组IL-17表达量均低于模型组，其中低剂量和高剂量极显著低于模型组(P<0.01)；Ubc13处理组各组IL-23表达量均低于模型组(P<0.05)，其中中剂量组与高剂量组mRNA表达量极显著低于模型组(P<0.001)。见图4。

3 讨论

Treg细胞和Th17细胞的平衡对维持免疫的稳态有重要作用，在CIA小鼠中，部分Treg细胞失去免疫抑制活性，T细胞稳态被破坏，造成多关节炎症。小鼠膝关节HE染色结果显示，小鼠关节在造模后56 d关节病理变化明显，与郭明等[20]的结果一致，提示CIA模型成功建立。与模型组相比，Ubc13处理组小鼠关节病症有一定程度的减轻，提示Ubc13对CIA小鼠关节有保护作用。

Treg细胞以来源不同分为胸腺来源的自然Treg细胞(nTreg)和外周来源的诱导型Treg细胞(iTreg)[21]，研究证实Ubc13影响CIA小鼠体内外周T细胞的免疫抑制活性，而对胸腺来源T细胞无显著影响[17]，因此本试验检测脾脏中Treg细胞数目。本研究中Ubc13处理的各组小鼠脾脏中Treg细胞比率显著上升，提示Ubc13对CIA小鼠体内Treg细胞免疫抑制活性有一定的恢复作用，与Chang等[16]的研究结果一致。与模型组相比，空白组Th17细胞比率无显著差异，提示Ubc13对IL-17蛋白水平表达无显著影响。

实时荧光定量PCR结果显示，CIA模型小鼠脾脏中IL-17、IL-23和RORc的表达显著上升，提示模型组小鼠脾脏中Th17细胞的过度活化。与对照组相比Ubc13处理的各组中IL-17、IL-23和RORc的表达显著降低。与模型组相比，Ubc13处理组RORc、IL-23和IL-17表达量显著降低，提示Ubc13通过降低RORc和IL-23的表达抑制Th17细胞的分化与IL-17的产生。

本研究中关节炎评分结果显示，模型组关节炎在二次免疫后开始发展，在第10天开始达到高峰，病症维持到二次免疫后56 d未见明显减轻。Ubc13处理的低剂量组与中剂量组关节炎评分与模型组无显著差异，Ubc13高剂量组小鼠关节炎评分与模型组相比有下降趋势，提示Ubc13对CIA有一定治疗作用，但效果不显著。

综上所述，Ubc13处理可导致CIA小鼠体内Treg细胞数目升高，抑制RORc、IL-23和IL-17的表达，减轻小鼠关节炎病症，为利用免疫细胞治疗类风湿性关节炎提供了一定的参考。