荧光标记MOMP抗体检测沙眼衣原体的方法及性能评价

刘小平，樊尚荣，陈晓明，黄 荣，闫津津

（1.北京大学深圳医院检验科，广东 深圳518036；2.北京大学深圳医院妇产科，广东 深圳518036；3.深圳迈克龙生物技术有限公司，广东 深圳518057；4.南方大学深圳医院检验科，广东 深圳518110）

沙眼衣原体（chlamydia trachomatis）是侵犯人类眼结膜、角膜和生殖道粘膜的病原体。可引起结膜炎、角膜炎。通过性传播引起男性尿道炎、附睾炎，女性宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎、输卵管炎，导致输卵管性不孕、异位妊娠、自然流产、早产和胎膜早破等，且可发生母婴传播，造成新生儿的包涵体性结膜炎和衣原体肺炎。目前用于临床的检验方法有微生物学检测方法、免疫学方法、核酸检测等［1-6］，所用试剂以进口为主［7-11］。本文建立了一种用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记沙眼衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体通过直接免疫荧光（direct immunofluorescence assay，DFA）实验检测生殖道感染沙眼衣原体的方法，现介绍如下。

材料与方法

1 材料

1.1 一般资料 标本采集于妇科门诊1个月内未使用抗生素、宫颈无肉眼可见的脓性分泌物患者。

1.2 宫颈分泌物样本采集 用灭菌拭子拭去宫颈口黏性分泌物，丢弃；用另一灭菌拭子插入宫颈管2～3厘米处缓缓转动一周、约10～15s抽出，抽出拭子时应避免接触到阴道壁。每例患者采集宫颈分泌物2支，分别编号。

1.3 样本保存 取样后如不能及时涂片或处理，样本需放入2～8℃冰箱保存。

1.4 制片 取出后立即将拭子涂在直径为8毫米的载玻片标记圈内。空气自然干燥后，用无水乙醇将玻片标本固定5min，待乙醇全部挥发后即可检测或置-20℃冰箱保存待检。

1.5 试剂 （1）异硫氰酸荧光素标记沙眼衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体（自制试剂）、细胞培养获得ATCC 沙眼衣原体菌株的包涵体。ATCC CCL-2（HeLa）上皮细胞株。ATCC49226淋病奈瑟菌、分离株淋病奈瑟菌5株，ATCC29213金黄色葡萄球菌、分离株金黄色葡萄球菌5株、分离株无乳链球菌。磷酸缓冲盐溶液（PBS），吐温，营养肉汤、去离子水等。（2）阳性质控物 灭活沙眼衣原体培养物。（3）阴性质控物：ATCC CCL-2（HeLa）上皮细胞培养物。（4）沙眼衣原体DNA检测试剂盒（购自中国广东中山达安基因股份有限公司，国械注准20163401027）。

1.6 仪器 荧光显微镜：蔡司Axioskop 2 plus荧光显微镜。

1.7 试验用其他器材 10uL移液器、标记圈载玻片、水浴箱、湿盒、盖片、甘油。实时荧光定量PCR扩增仪（ABI 7500），离心机等。

2 方法

2.1 FITC标记MOMP单克隆抗体制备过程

（1）用透析袋将MOMP单克隆抗体用碳酸盐缓冲盐4℃，透析16h。

（2）称取少量的FITC粉末，用DMSO溶解至终浓度为10mg/mL。

（3）将透析过的抗体收集到干净的离心管内，按1mg抗体：10mg/mL FITC＝1∶6的比例混匀，在室温避光的条件下，反应2h。

（4）用透析袋将FITC标记的MOMP单克隆抗体用PBS（7.4）缓冲液，4℃，透析过夜，除去游离的FITC，透析完成后，将抗体收集到干净的离心管内，避光，4℃保存。

2.2 阳性质控物的涂片制备

沙眼衣原体培养物：收集、纯化沙眼衣原体，4℃10000RCF离心10min，弃上清。

吸取1ml甲醛添加到沉淀上，轻轻吹打混匀，放置10min后，4℃10000RCF离心10min，收集沉淀。沉淀低温干燥后，用1mL生理盐水溶解，留待制作试剂质控物。

（1）稀释

采用生理盐水溶液对沙眼衣原体培养物稀释。

（2）制片

用加样枪分别吸20μL沙眼衣原体悬液均匀涂布在载玻片上。避免反复涂布、避免移液器吸头破坏细胞包涵体/沙眼衣原体。

（3）固定

用乙醇固定10min，室温干燥、备用。

2.3 检测试剂的分析性能评价

运用单一变量法，分别评价沙眼衣原体涂片介质类型、试剂用量、反应时间、孵育温度、孵育湿度、冲洗用水对试验结果的影响。质控涂片检测采用已确定的最佳反应条件。试验用菌株为沙眼衣原体培养株。

2.3.1 涂片介质的选择 试验菌株为自制阳性质控物，介质类型包括生理盐水、营养肉汤、乙醇。分别用生理盐水、营养肉汤作为涂片介质蘸取沙眼衣原体培养物滚动制片各10张，自然干燥，其余步骤采用已确定的最佳反应条件。

2.3.2 涂片介质pH值 用1M乙酸稀释溶液、生理盐水、1M碳酸氢钠溶液用于涂片介质调整试验pH，在pH值＜7.0、pH值等于7.0和pH值＞7.0时制备沙眼衣原体菌株涂片各10片，自然干燥其余步骤采用已确定的最佳反应条件。

2.3.3 试剂用量确定 制备沙眼衣原体涂片30片，自然干燥分别5μL、8μL、10μL沙眼衣原体免疫荧光试剂。

2.3.4 反应时间 制备沙眼衣原体涂片30片，自然干燥后加入5μL沙眼衣原体免疫荧光试剂分别作用20min、30min和45 min，观察结果。

2.3.5 孵育温度和湿度 制备沙眼衣原体涂片各10片，加入沙眼衣原体免疫荧光试剂后分别放置在室温（26～30℃）、37℃水浴，37℃培养箱、37℃保湿暗盒，30 min后冲洗、晾干、观察结果。

2.3.6 冲洗用水 制备沙眼衣原体涂片各10片，加5μL沙眼衣原体免疫荧光试剂后分别放置在保湿暗盒37℃，30min后分别用自来水、去离子水和PBS+吐温冲洗，观察结果。

2.3.7 抗体特异性检测 分析的菌株有：ATCC49226淋病奈瑟菌、淋病奈瑟菌分离株，ATCC29213金黄色葡萄球菌，无乳链球菌分离株。

2.3.8 结果判断 在荧光显微镜下（10×100）有10个以上染成明亮苹果绿色的原体、始体或细细胞内包涵体为阳性。

2.4 标本检测 在标本载玻片加入5μL FITC标记的主要外膜蛋白单克隆抗体，使其覆盖整个孔，湿盒内室温反应30min。取出后用缓冲液冲洗3次，每次30s，最后用去离子水冲洗1次。晾干，备检。pH7.2甘油封片。

2.4.1 检验方法 将样本轻缓滚动涂抹在载玻片圆圈内，充分晾干，使用乙固定10min，自然晾干，滴加荧光标记沙眼衣原体抗体，均匀涂布，置于37℃水浴箱孵育30min。应避免试剂在玻片上干燥。孵育后，使用自来水缓缓冲洗玻片30s。将玻片吹干或自然晾干。

2.4.2 荧光显微镜进行阅片 油镜下（100×10）寻找发苹果绿色荧光的典型圆球形沙眼衣原体颗粒，如不能马上观察样本，建议将其置于2-8℃环境下避光保存。

结果判读 观察全片视野，累计发现10个及10个以上苹果绿色典型圆球形沙眼衣原体颗粒即为阳性。如标本涂片中可见10个以上上皮细胞，未见到原体、始体荧光颗粒或包涵体，报告为阴性。

如标本涂片中细胞少于10个且未见到衣原体荧光颗粒，则应考虑标本采集或涂片制作不当所致。否则判定为阴性。若发现不典型的疑似结果以及不可解释的结果时应重新采集样本进行再次检测。

2.4.3 质量控制 质控片与标本片同样染色过程，在荧光显微镜下，阳标本在红色背景中有染成明亮苹果绿色的原体、始体或细细胞内包涵体。

2.5 沙眼衣原体DNA检测（PCR-荧光探针法）

2.5.1 沙眼衣原体标本和阴、临界阳性质控品、DNA提取 标本管内加入1mL生理盐水，充分震荡、混匀，转入1.5mL离心管，15000rpm，15min，弃上清；沉淀加入1mL无菌生理盐水混匀，12000转/分离心5min，再重复一次。沉淀加入50uLDNA提取液，充分混匀，100℃干浴10min，12000rpm 离心5min，备用。阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品同法处理。

2.5.2 PCR扩增 取PCR反应管，分别加入待测标本提取物、质控品2μL，盖好离心管盖，6500rpm离心数s。将反应管放入扩增仪内扩增。按照以下程序扩增：93℃预变性2min，然后按93℃、45s，55℃、60s先做10个循环，最后按93℃、30s，55℃、45s，做30个循环。荧光采集点为55℃、45s。

2.5.3 质量控制 每次试验必须有阴、强阳性质控品、临界阳性质控品。

2.6 两组实验结束后，解盲并统计两组的实验结果

3 统计学分析

采用Kappa系数一致性检验。

结 果

1 异硫氰酸标记沙眼衣原体主要外膜蛋白抗体检测试剂的最佳反应条件

根据实验结果，确定沙眼衣原体检测试剂的最佳反应条件为：营养肉汤作为涂片介质、pH值7.0，试剂量8μL，孵育时间45min，孵育温度37℃，孵育环境保持一定湿度，恒温水浴最佳，PBS+吐温洗剂可作为冲洗用水。

若无营养肉汤可用生理盐水涂片。若无PBS+吐温洗剂，去离子水与自来水也可作为冲洗用水。反应过程避光。见表1。

2 异硫氰酸标记沙眼衣原体主要外膜蛋白抗体特异性

与淋病奈瑟菌标准株、分离株，金黄色葡萄球菌标准株、分离株，与无乳链球菌分离株均无反应。与生殖道常见的球菌无交叉反应。适用于生殖道感染标本。见表1、图1。

表1 沙眼衣原体检测试剂最佳反应条件

续表

图1 FTIC标记主要外膜蛋白单克隆抗体检测沙眼衣原体及交叉实验（100×10）

3 异硫氰酸标记沙眼衣原体主要外膜蛋白抗体和PCR法检测临床样本

按照最佳反应条件对临床试验样本共142份进行了检测，异硫氰酸荧光素标记沙眼衣原体主要外膜蛋白抗体检测出阳性10例，阴性132例；PCR法共检测出阳性11例，阴性131例。与PCR法相比，异硫氰酸荧光素标记沙眼衣原体主要外膜蛋白抗体准确率为99.3%，灵敏度为90.9%，特异性为100%，见下表2。Kappa系数0.894，Kappa一致性检验，两种方法结果一致。

表2 异硫氰酸标记沙眼衣原体主要外膜蛋白抗体与PCR检测结果比较

由此得出硫氰酸标记沙眼衣原体主要外膜蛋白抗体检测沙眼衣原体与PCR结果几乎完全一致。操作过程简便，适于临床样本沙眼衣原体的检测。

讨 论

沙眼衣原体感染的流行病学 据世界卫生组织（WHO）报道，2012年，青少年及成年人（15～49岁）新增了1.31亿人次感染沙眼衣原体，全球感染沙眼衣原体的发病率，女性为3.8%，男性为3.3%，在国内的性传播疾病中，生殖道沙眼衣原体感染的每年平均发生率为1.95%，其中20～29岁生殖道沙眼衣原体感染的发生率最高。

北京倪安平等报道检测孕妇、盆腔炎患者和STD男女就诊者生殖道沙眼衣原体阳性率分别为3.3%，6.7%，20.4%和15.6%［1］。广东生殖道沙眼衣原体的感染发生率从2006年的每十万人有0.5人升到了2014年每十万人有51.3人［5］。

大陆地区各医疗机构所用沙眼衣原体检测试剂大部分为进口产品，以英国立明、梅里埃、雅培等公司的产品为主，国产品牌的试剂常因质量问题得不到用户认可。研发快速、准确、廉价，能给医生提供可靠诊疗依据的试剂、研发有自主知识产权的试剂，对降低检验成本有积极意义，并促进转化医学的发展。

MOMP的抗原性MOMP为沙眼衣原体的主要蛋白成分，MOMP蛋白的分子量为40kDa，由387～397个氨基酸残基组成富含半胱氨酸的跨膜蛋白，等电点为5.13～5.15。它的结构包含有16个跨膜区域。有较强的抗原性［12］，可诱导机体产生特异性中和抗体，并且作为抗体的特异性靶抗原［13-14］。衣原体主要外膜蛋白（MOMP）由Opml基因编码，是沙眼衣原体的表面优势蛋白，占外膜蛋白60%，在衣原体各型别间具有84%～97%的同源性。

重组主要外膜蛋白MOMP提取天然的MOMP蛋白费时费力，不能满足试剂生产的需要。HE等［15］报道，表达沙眼衣原体的重组主要外膜蛋白（rMOMP），由于MOMP内部结构非常复杂，导致MOMP蛋白很难重组合成且不能准确的折叠，表达量也不高。用无细胞表达系统来表达重组MOMP蛋白作为免疫原，能成功表达该蛋白，MOMP蛋白免疫小鼠，产生的抗体，经过免疫印迹实验（western blot）及酶联免疫吸附试验（ELISA）等实验证明，无细胞表达的重组MOMP蛋白产生的抗体能检测沙眼衣原体。Pengfei Jiang等通过生物信息学的手段，利用MOMP261-276、MOMP70-81及MOMP370-387三段多肽作为免疫原，通过western blot，ELISA及荧光免疫法（IFA）等实验，证实了MOMP的三段特异性多肽能作为检测沙眼衣原体的免疫原。

标记MOMP抗体 标记异硫氰酸荧光素（FITC）的抗体与沙眼衣原体抗原结合，在荧光显微镜下，能发出苹果绿的荧光，通过苹果绿的荧光及形态判断沙眼衣原体。由于FITC分子量小，用其标记抗体不会影响抗体与抗原的结合［2］，如上所述，多数研究者选择用MOMP蛋白作为免疫原，因为MOMP蛋白是15种沙眼衣原体都存在特异性蛋白，通过免疫兔或小鼠，获得的血清，利用特异性抗原或protein G亲和柱纯化血清中的IgG抗体，将IgG抗体标记FITC后，标记了FITC的抗体与沙眼衣原体抗原特异性结合，在荧光显微镜下可以观察到。

标记检测方法比较和应用 沙眼衣原体培养和直接免疫荧光分析（DFA）、酶免疫分析（EIA）、核酸杂交测试和核酸扩增检测（NAAT）均可用于在宫颈管和男性的尿道拭子沙眼衣原体诊断。沙眼衣原体培养是检测方法的金标准。NAAT是美国食品药物管理局（FDA）批准用于尿液或阴道拭子最敏感的诊断沙眼衣原体感染的方法［16］。

非特异性染色是免疫荧光法观察沙眼衣原体时的干扰。对于生殖道标本中可能存在的形态为球形的细菌如金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、无乳链球菌做了交叉实验，排除了观察过程的干扰。荧光标记MOMP抗体检测沙眼衣原体的方法快速、直观，结果与基因扩增有较好的一致性，适合临床诊断［17］。