肾阳虚水肿证代谢组学的研究

周 宁, 郑晓珂*, 李 凯,2, 牛 艳, 李星灿, 匡海学, 冯卫生,2*

(1.河南中医药大学,河南 郑州450046；2.呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心,河南 郑州450046；3.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨150040)

《素问·调逆论》云： “肾者,水脏,主津液”［1］,肾接纳津液后分清与浊,清者蒸腾向上达于肺而濡养全身,浊者气化向下注入膀胧而排出体外,“肾主水” 异常会导致机体水液代谢失调,进而形成水肿［2］。在正常生理状态下,机体之肾阴与肾阳相对平衡,故无论是肾阴还是肾阳亏竭,均会导致“肾主水” 之功能异常,从而引起机体水液代谢障碍,并诱发水肿,肾阴亏虚则阴虚火旺、代谢亢进,而肾阳亏虚则阳气不足、代谢滞缓。

课题组前期已经通过“阿霉素+甲状腺片” 的复合造模法建立肾阴虚水肿模型［3］,并进行相关代谢组学研究,得到其代谢轮廓特征、相关生物标志物、受干扰的代谢通路和网络［4］；本实验拟采用“阿霉素+氢化可的松” 复合造模法建立肾阳虚水肿模型［5］,以期从代谢组学的角度初步揭示其发病机理,并通过比较病理变化、代谢异常、共有标志物水平在肾阴虚、阳虚水肿模型中变化趋势的异同,筛选出可用于区分2 种证型的潜在生物标志物,从而为中医辩证研究提供新思路。

1 材料

1.1 动物 SD 大鼠,体质量180 ～220 g,雄性,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(京) 2012-0001,均饲养于(20±2)℃、相对湿度(60±10)%的清洁级动物实验室内,昼夜交替,自由摄食饮水。

1.2 试药 阿霉素注射粉末(山西普德药业股份有限公司,批号02160103)；氢化可的松注射液(上海现代哈森药业股份有限公司, 批号1502132)；桂附地黄丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,批号15050630)。0.9%生理盐水 (河南科伦药业有限责任公司, 批号H20003438)；乙腈为色谱纯(美国Fisher Chemical公司)； 甲酸为质谱纯 (美国Anaqua Chemicals Supply 公司)。

1.3 仪器 maXis HD 四级杆-飞行时间质谱(德国Bruker 公司)；Dionex UltiMate 3000 超高效液相色谱仪(美国Thermo Scientific 公司)；iMark 酶标仪(美国Bio-Rad 格式)。

2 方法

2.1 分组与造模 30 只大鼠适应性喂养1 周后,随机分成正常组(8 只) 和造模组(22 只),其中造模组大鼠第1 天尾静脉注射4 mg/kg 阿霉素,第8 天尾静脉注射3.5 mg/kg 阿霉素,同时开始腹腔注射氢化可的松,连续15 d,造模结束后将成模大鼠分成肾阳虚水肿模型组和阳性药组。正常组、模型组大鼠给予蒸馏水(1 mL/100 g),而阳性药组大鼠给予桂附地黄丸混悬液(4.38 mg/kg)。

2.2 样品采集与处理 代谢笼收集各组大鼠24 h尿液,10%水合氯醛麻醉后腹主动脉取血,分别收集血清、血浆,置于-80 ℃超低温冰箱中冷冻保存。进样前,尿液在冰水浴下解冻,12 000 r/min离心10 min,将1 mL 上清液与3 倍量乙腈混合后涡旋60 s,12 000 r/mim 再离心10 min,吸取适量上清液于进样瓶中,进行UPLC-Q/TOF-MS 分析。

2.3 一般状况观察与生化指标检测 观察大鼠的身体状态和一般行为特征,同时检测各组大鼠尿蛋白及血中环磷酸腺苷 (cAMP)、 环磷酸鸟苷(cGMP)、肌酐、尿素氮、白蛋白水平,进而对肾阳虚水肿模型的建立进行评价。

2.4 液质分析条件

2.4.1 色谱条件 色谱分离采用AcclaimTMRSLC 120 C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.2 μm)；进样量2 μL；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；流动相0.1%甲酸-水(A) 和乙腈(B),梯度洗脱(0 ～1 min,2 ～10% B；1 ～9 min,10 ～20% B；9 ～16 min,20～30%B；16～20 min,30～98%B)。

2.4.2 质谱条件 电喷雾离子化源(ESI),正、负离子源模式下毛细管电压分别为3 500、3 200 V；质量扫描范围m/z 50～1 500；雾化气压、干燥气温度和干燥气体积流量分别为200 kPa、230 ℃和8 L/h。

2.5 代谢轮廓分析 利用Q/TOF-MS 配套软件Data Analysis 2.1 对原始谱图数据进行滤噪、校正和峰对齐,将处理后的数据在Profile Analysis 软件中打开,进行归一化处理和bucket 列表生成,再将bucket 列表导入SIMCA-P 13.0 软件进行主成分分析(PCA),所得PCA 得分散点图可直观反映各实验组大鼠之间的代谢轮廓差异［6］。

2.6 生物标志物筛选与鉴定 在主成分分析基础上进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),生成OPLS-DA 得分散点图、S-plot 散点图、VIP 列表,利用t 检验(P＜0.05) 和VIP 值(VIP＞1.5)对潜在生物标志物进行初步筛选, 结合Metlin、HMDB、KEGG 等在线数据库作进一步地鉴别。最后,通过MeV 软件绘制生物标志物水平量化处理结果的热度图。

2.7 代谢通路富集分析与网络构建 将潜在生物标志物导入MBRole 数据库 (http： //csbg.cnb.csic.es/mbrole2) 进行代谢通路富集分析,获得显著受到干扰的代谢通路,再结合KEGG(http： //www.kegg.jp/) 等在线数据库的相关信息构建肾阳虚水肿模型受干扰的代谢网络。

3 结果与讨论

3.1 一般状况与生化指标 模型组大鼠出现脱毛、毛色无光、牙齿脱落、不爱动、怕冷、便溏等肾阳虚症状,而给予阳性药后上述症状均得到显著改善［7］。血中cAMP、cGMP 水平及比值变化是区分肾阴虚、阳虚证的关键指标［3］,表1 显示,与正常组比较,肾阳虚水肿模型组大鼠cAMP 水平显著降低(P＜0.01)、cGMP 水平显著升高(P ＜0.05),两者比值降低,而给予阳性药后比值显著升高,表明造模成功［8-9］。血肌酐和尿素氮能客观地反映肾小球滤过率,是临床上评估肾功能损伤的常规指标［10］,表1 显示,肾阳虚水肿模型组大鼠血肌酐、尿素氮、尿蛋白水平较正常组均显著升高 (P ＜0.05,P＜0.01),同时出现低蛋白血症,而给予阳性药后各项指标均得到不同程度的改善,表明大鼠肾功能受损并伴有水肿症状。

3.2 代谢轮廓 对尿液分析条件进行优化后,得到具有最优分离度和峰形的基峰色谱图,见图1。

图2A 显示,正常组、肾阳虚水肿模型组样品在PCA 得分散点图中各自聚为一类,2 组分离趋势明显,表明模型大鼠体内代谢水平发生明显波动,偏离正常状态。图2B 显示,阳性药组样本点与正常组聚为一类,进一步确认造模成功。

表1 3 组生化指标比较，n=6）Tab.1 Comparison of biochemical indices among the three groups，n=6）

表1 3 组生化指标比较，n=6）Tab.1 Comparison of biochemical indices among the three groups，n=6）

注：与正常组比较,*P＜0.05,**P＜0.01；与肾阳虚水肿模型组比较,＃＃P＜0.01

组别 (n cmAoMl·PL-/1)(n cmGoMl·PL/-1)(m尿g·蛋24白 h-/1)(白g·蛋L白-1)/(μm肌o酐l·L/-1)(m尿m素ol·氮L-/1)正常组 35.40±1.01 10.72±0.74 6.20±1.88 32.81±1.82 29.17±5.98 5.78±0.42肾阳虚水肿模型组 27.84±2.41** 11.84±0.89* 212.21±91.00** 23.20±0.66** 50.77±4.08** 7.20±0.92*阳性药组 28.32±2.63 9.45±0.87＃＃ 175.07±53.29 23.58±0.91 34.05±5.96＃＃ 5.44±0.69＃＃

图1 尿液基峰色谱图Fig.1 Base peak chromatograms of urine

3.3 肾阳虚水肿模型相关生物标志物 图2C 显示,正常组、肾阳虚水肿模型组样品在OPLS-DA得分散点图中明显分离,与其对应的S-Plot 散点图(图2D) 中菱形标志为P＜0.05 且VIP＞1.5 的代谢物,距离原点越远的代谢物对组间差异贡献度越大。结合HMDB、KEGG 等在线数据库,最终鉴定40 个相关生物标志物,其中负源模式下21 个,正源模式下19 个,见表2。图3 显示,与正常组比较,肾阳虚水肿模型组标志物水平有21 个呈上调变化,19 个呈下调变化。

3.4 肾阳虚水肿模型相关代谢通路 将表2 生物标志物导入MBRole 数据库进行代谢通路得富集分析,结果见表3,可知大鼠体内受到显著干扰的代谢通路有苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、嘧啶代谢。

图2 样品散点图Fig.2 Scatter plots for samples

表2 肾阳虚水肿模型相关生物标志物Tab.2 Relevant biomarkers for edema model of Kidney Yang Deficiency

续表2

图3 生物标志物热度图Fig.3 Heatmap for biomarkers

表3 肾阳虚水肿模型相关代谢通路Tab.3 Relevant metabolic pathways for edema model of Kidney Yang Deficiency

3.5 肾阳虚水肿模型相关代谢网络 在代谢通路富集分析的基础上,结合KEGG 在线数据库中色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、丙酮酸代谢、组氨酸代谢、嘧啶代谢等相关通路信息,构建肾阳虚水肿模型大鼠体内受干扰的代谢网络,见图4,可知受干扰的苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、嘧啶代谢、组氨酸代谢之间通过丙酮酸代谢相互关联,且这些代谢紊乱与肾阳虚水肿证的病理变化密切相关。

3.5.1 苯丙氨酸代谢紊乱与肾脏毒素蓄积 图3 ～4 显示,肾阳虚水肿模型大鼠尿液中乙醛、苯乙酸水平上调,苯乙酰甘氨酸、硫酸对甲酚水平下调,表明大鼠体内有苯丙氨酸代谢紊乱；大鼠尿液中硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚水平下调,表明两者在大鼠体内存在蓄积。硫酸对甲酚和硫酸吲哚酚均为氨基酸的肠道微生物代谢产物,并具有肾脏毒性,可引起肾脏损伤,加重肾脏功能不全［4,11］,可知大鼠体内苯丙氨酸代谢紊乱与其肾脏毒素蓄积、肾功能损伤、水肿发生密切相关。

图4 肾阳虚水肿模型受干扰代谢网络Fig.4 Disturbed metabolic network of edema model of Kidney Yang Deficiency

3.5.2 色氨酸代谢紊乱 色氨酸代谢在行为、情绪、生长、免疫应答的调节过程中均发挥关键作用［12］,其主要途径为犬尿氨酸途径和5-羟色胺途径［4］。图4 显示,肾阳虚水肿模型大鼠体内色氨酸代谢异常主要集中在5-羟色胺途径,其2 个下游代谢物5-羟基吲哚乙醛和5-羟基犬尿胺在尿液中的水平均下调,表明其水平呈上调变化。5-羟色胺可参与调节行为、睡眠、饮食、体温等多种生理及代谢机能［13］,当其水平较高时容易出现反射亢进、发汗、 恶寒、 振颤、 腹泻、 协调运动障碍等症状［14］,由此推测,大鼠出现的一系列耗竭现象(如活动减少、体重下降、蜷缩、拱背、畏寒、腹泻等) 可能与其水平上调有密切关联。

3.5.3 组氨酸、精氨酸和嘧啶代谢紊乱 图4 显示,肾阳虚水肿模型大鼠体内显著受到干扰的代谢通路还有组氨酸代谢、精氨酸代谢、 嘧啶代谢,三者均与机体的免疫调节密切相关［4,15］,故其发生紊乱时势必引发肾阳虚水肿模型大鼠免疫机能下降。

3.6 肾阳虚、阴虚水肿模型比较 课题组前期已经通过“阿霉素+甲状腺片” 复合造模法建立肾阴虚水肿模型,并进行相关代谢组学研究,得到肾阴虚水肿模型的代谢轮廓特征、相关生物标志物、受干扰的代谢通路和代谢网络［4］。表4 显示,苯乙酰甘氨酸、硫酸对甲酚、乙醛、苯乙酸、硫酸吲哚酚、α-酮戊二酸、肌酐在2 种模型中的变化趋势相同,主要代谢通路为与肾脏功能损伤、水肿发生密切相关的苯丙氨酸代谢；4,6-二羟基喹啉、3-甲基二氧化吲哚、5-羟基吲哚乙醛、5 羟基犬尿胺、尿嘧啶、尿苷、乳清酸、3-脲基丙酸、1-甲基组胺、咪唑乙酸在2 种模型中的变化趋势相反,主要代谢通路为与肾阴虚、阳虚证密切相关的色氨酸代谢,以及与免疫功能紊乱密切相关的组氨酸代谢和嘧啶代谢。

表4 肾阴虚、阳虚水肿模型共有生物标志物Tab.4 Shared biomarkers for edema models of Kidney Yin Deficiency and Kidney Yang Deficiency

4 结论

肾阳虚水肿模型大鼠体内苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、组氨酸代谢、精氨酸代谢、嘧啶代谢等多条通路受到明显干扰,与大鼠肾脏功能损伤、水肿发生、耗竭症状、免疫功能紊乱均密切相关。肾阴虚、阳虚水肿模型中存在的肾脏功能损伤、水肿情况与2 种模型中类似的苯丙氨酸代谢紊乱有关；两者之间迥异的动物状态(肾阴虚动物之躁动、易惊、进食减少,肾阳虚动物之耗竭) 和免疫功能紊乱情况则主要与模型中波动趋势相反的色氨酸、嘧啶、组氨酸代谢紊乱有关,初步确定4,6-二羟基喹啉、3-甲基二氧化吲哚、5-羟基吲哚乙醛、5-羟基犬尿胺、尿嘧啶、尿苷、乳清酸、3-脲基丙酸、1-甲基组胺、咪唑乙酸等10 种代谢物可作为区分肾阴虚、阳虚证的潜在生物标志物。然而,本研究结果仅是基于肾阴虚、阳虚水肿模型的比较而初步得出,还有待于后期补充完善。