黄芩总黄酮纳米混悬剂冻干粉的表征及辅料对其粉体学性质和吸湿性的影响

赵甜甜, 李小芳, 马祖兵, 孙 强, 刘罗娜, 仲 粒

(成都中医药大学药学院,中药材标准化教育部重点实验室,四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地,四川 成都611137)

黄芩总黄酮是从唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi 干燥根中分离得到的成分,主要包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素,具有多种药理活性,如解热抗炎、抗氧化、保肝、抗病毒、抗肿瘤［1］等,临床上广泛应用于病毒性肝炎、肺炎、肠炎、上呼吸道感染等疾病的治疗［2］。但其水溶性较差,生物利用度低［3］,影响了临床广泛应用。

纳米混悬剂有着制备简单、辅料用量少等优势,已广泛应用于难溶性药物增溶研究中,故本实验将制备黄芩总黄酮纳米混悬剂冻干粉。另外,同一化学结构的药物由于制备工艺的影响,其晶型会发生改变［4］,从而在稳定性、溶出度、生物利用度方面存在差异［5］,故本实验通过差示扫描量热(DSC)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、X 射线粉末衍射(XRD) 对纳米混悬剂冻干粉进行结构表征,并考察辅料对其粉体学性质和吸湿性的影响,以期为黄芩总黄酮相关制剂开发提供依据。

1 材料

Nicomp 380ZLS 型激光粒度仪(美国PSS 粒度仪公司)；AH-100D 型高压均质机(加拿大ATS 公司)；Nicolet 6700 型傅里叶红外光谱仪(美国赛默飞世尔科技公司)；HSC-1 型差示扫描量热仪(北京恒久科学仪器厂)；Mini Fiex 600 型X 射线衍射仪(日本Rigaku 公司)；UV-6000 型紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；SJIA-10N-50 型冷冻干燥机(宁波市双嘉仪器有限公司)；ZRS-8G型智能溶出试验仪 (天津市天大天发科技有限公司)。

黄芩总黄酮原料药(西安小草植物科技有限责任公司, 批号XC20180112, 总黄酮含有量85%)；黄芩苷对照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批号MUST-14083014,含有量98%)。泊洛沙姆188(德国巴斯夫公司,批号WPAK539B)；聚乙二醇400、甘露醇、羧甲基淀粉钠、糊精、滑石粉、可溶性淀粉、微晶纤维素均为分析纯,购自成都市科龙化工试剂厂。

2 方法与结果

2.1 线性关系考察 精密称取黄芩苷对照品10.9 mg于100 mL 量瓶中,无水乙醇超声溶解并定容,摇匀,制得109.0 μg/mL 溶液,无水乙醇稀释成8.72、 9.81、 10.9、 11.99、 13.08 μg/mL,以无水乙醇为空白对照,在277.0 nm 波长处测定吸光度。以黄芩苷质量浓度为横坐标(X),吸光度为纵坐标(A) 进行回归,得方程为A ＝0.053X+0.06(R2＝0.999 7),在8.72 ～13.08 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.2 纳米混悬液制备 采用沉淀-高压均质法。取黄芩总黄酮0.51 g,加入10 mL 无水乙醇,室温下超声溶解, 作为有机相； 取稳定剂 (P188 ∶PEG400＝1 ∶1) 0.52 g,溶于100 mL 纯水中,作为水相,持续搅拌水相至无气泡时,将有机相匀速注入水相中,700 r/min 下持拌15 min,55 ℃水浴中旋蒸除尽乙醇,得到粗混悬液。然后,将上述混悬液转入高压均质机中,先于50 MPa 下预均质循环2 次,再于100 MPa 下均质循环16 次,即得。

2.3 纳米混悬剂冻干粉制备 取“2.2” 项下纳米混悬剂,加入4%甘露醇后分装于西林瓶中,采用慢冻方式,经3 ℃ (2 h) 预冷、-18 ℃(12 h)、-70 ℃ (12 h) 分步预冻后减压干燥48 h,即得。

2.4 物理混合物制备 依次称取黄芩总黄酮0.51 g、P188 260 mg、PEG-400 260 mg,纯水混匀,加入4%甘露醇,按“2.3” 项下方法制备,即得。

2.5 空白辅料制备 依次称取P188 260 mg、PEG-400 260 mg,纯水混匀,加入4%甘露醇,按“2.3” 项下方法制备,即得。

2.6 体外溶出度测定 取纳米混悬剂冻干粉、物理混合物适量(各含黄芩总黄酮10 mg),按2015年版《中国药典》 四部0931 第二法(桨法) 测定溶出度,介质900 mL 超纯水,温度(37±0.5)℃,转速100 r/min。从药物粉末与溶出介质液面接触时开 始 计 时, 分 别 于5、 10、 20、 30、 40、 50、60 min各取样5 mL(同时补加5 mL 等温介质超纯水),0.45 μm 微孔滤膜过滤,计算溶出率,结果见图1。由图可知,纳米混悬剂冻干粉在60 min 内的溶出度达到88.4%,而物理混合物仅为28.7%。

图1 样品溶出曲线Fig.1 Dissolution curves for samples

2.7 理化性质研究

2.7.1 差示扫描量热(DSC) 分析 取空白辅料、黄芩总黄酮、纳米混悬剂冻干粉、物理混合物适量,进行DSC 分析,条件为升温速率10 ℃/min,扫描范围30～350 ℃,结果见图2。由图可知,空白辅料在154.31 ℃处有特征吸热峰；黄芩总黄酮在225.94 ℃处有明显吸热峰； 物理混合物在155.93 ℃处有辅料吸热峰,黄芩总黄酮特征峰向低温方向发生了移动,可能是辅料和药物熔融时互相 影 响 造 成 的［6］； 纳 米 混 悬 剂 冻 干 粉 仅 在153.37 ℃处有辅料吸热峰,而黄芩总黄酮特征峰消失,表明药物可能以无定形状态均匀分散在载体中。

图2 样品DSC 曲线Fig.2 DSC curves for samples

2.7.2 X 射线衍射(XRD) 分析 取空白辅料、黄芩总黄酮、纳米混悬剂冻干粉、物理混合物适量,进行XRD 分析,条件为Cu 靶,K 线,电压40 kV,步长0.02°,扫描范围5°～90°,结果见图3。 由 图 可 知, 黄 芩 总 黄 酮 在9.06°、 10.44°、12.50°、14.75°、17.07°、23.85°、28.03°处有明显的衍射峰,具有完整的晶型状态；物理混合物中药物晶体衍射峰强度有所减弱,并稍移动,可能是辅料和药物在简单的搅拌混合过程中发生了较弱的相互作用,但依然能清晰分辨出药物特征衍射峰,即在载体中的晶型并未发生改变；纳米混悬剂冻干粉中药物特征衍射峰消失,其结构由晶体转变为无定形状态［7］。

图3 样品XRD 图Fig.3 XRD patterns for samples

2.7.3 傅里叶红外变换(FT-IR) 分析 取空白辅料、黄芩总黄酮、纳米混悬剂冻干粉、物理混合物适量,采用KBr 压片法,在4 000～400 cm-1处扫描,进行FT-IR 分析,结果见图4。由图可知,黄芩总黄酮分别在3 550.36、1 726.69、1 660.01 cm-1处有-OH、C ＝O、 C ＝C 伸 缩 振 动 峰, 在1 301.15、1 200.73 cm-1处分别为苯环骨架上的C-H 弯曲振动、C＝C 伸缩振动特征峰,在1 252.00、1 065.84 cm-1处出现 C-O-C 伸缩振动峰； 空白辅料在1 197.02 cm-1处的吸收峰对物理混合物造成干扰,导致其苯环骨架上的C ＝C 伸缩振动特征峰消失,但药物其他几个特征峰依然存在；纳米混悬剂冻干粉吸收峰与物理混合物相似,即药物与载体之间无相互作用。

图4 样品FT-IR 光谱图Fig.4 FT-IR spectra for samples

2.8 辅料对粉体学基本性质的影响

2.8.1 休止角 采用固定圆锥法测定。将玻璃漏斗固定在铁架台上,漏斗下端距离水平桌面高为H,取冻干粉、冻干粉与辅料混合粉(2 ∶1) 适量,使药粉从漏斗上面均匀流下,直到圆锥体顶点与漏斗下端接触为止,测量圆锥体直径2R,平行3次,取平均值,再计算休止角θ,公式为θ ＝arctg(H/R)。结果见表1。

2.8.2 堆密度 取已称重的10 mL 量筒,质量记为m,用漏斗将适量冻干粉、冻干粉与辅料混合粉(2 ∶1) 匀速注入量筒中,精密称定质量,记为M,同时记录粉末体积V1,平行3 次,取平均值,计算堆密度ρ1,公式为ρ1＝ (M-m) /V1。结果见表1。

2.8.3 振实密度 将“2.8.2” 项下装有一定体积药粉的量筒从距离水平桌面大概2 cm 处自由下落,重复15 次,记录粉末体积V2,计算堆密度ρ2,公式为ρ2＝ (M-m) /V2。结果见表1。

2.8.4 溶出度 取适量冻干粉与辅料混合粉(2 ∶1),按“2.6” 项下方法测定溶出度。结果见表1。

表1 5 种辅料对纳米混悬剂冻干粉粉体学性质的影响（n=3）Tab.1 Effects of five excipients on the powder properties of nanosuspension lyophilized powder（n=3）

2.8.5 结果分析 一般情况下,θ＜30°表明流动性良好,＞45°表明流动性较差［8］。由表1 可知,纳米混悬剂冻干粉的休止角约为42.30°,流动性较差；加入滑石粉、糊精后有所减小,表明两者可改善其流动性；加入糊精后堆密度和振实密度最大,表明该混合粉蓬松,有利于填充,而且粒子之间的黏附力和摩擦力最小, 有利于粉体流动和堆积［9-10］；溶出度无明显变化,表明辅料不影响药物溶出。

2.9 辅料对吸湿性的影响

2.9.1 吸湿率 配制氯化钠过饱和溶液(相对湿度75%) 于干燥器中,25 ℃下饱和24 h。称取纳米混悬剂冻干粉、冻干粉与辅料(2 ∶1) 混合粉各0.3 g,混合均匀后置于干燥器内恒重48 h,平铺在已饱和的具塞称量瓶(敞口) 中,精密称定质量后置于干燥器中,于第0、1、2、3、4、6、8、10 天取样称重,计算吸湿率,公式为吸湿率＝［(吸湿后样品质量-吸湿前样品质量) /吸湿前样品质量］ ×100%,以时间为横坐标,吸湿率为纵坐标绘制吸湿曲线,见图5。由图可知,不同辅料对纳米混悬剂冻干粉吸湿性的影响不同,其中羧甲基淀粉钠可加剧吸湿过程,可溶性淀粉与微晶纤维素的阻湿过程相近,滑石粉与糊精的阻湿过程相近,并优于前者。

图5 辅料吸湿曲线Fig.5 Moisture absorption curves for excipients

2.9.2 吸湿方程 由于吸湿加速度越小,平衡吸湿率、样品吸湿能力越低［11］,故本实验以吸湿加速度和平衡吸湿率为指标,考察辅料对纳米混悬剂冻干粉吸湿性的影响。根据“2.9.1”项下测得吸湿率进行二项式回归拟合,得吸湿方程为w ＝at2+bt+c(w 为吸湿率,t 为吸湿时间,a、b、c 均为常数),对其进行一阶求导,得吸湿速率方程为v ＝dw/dt ＝2at+b,再对其进行一阶求导,得吸湿加速度方程为v′＝dv/dt ＝2a,当吸湿速率为0 时可得到平衡吸湿率,结果见表2。由表可知,多项式拟合方程相关系数R2都接近1,表明拟合效果良好,吸湿加速度依次为滑石粉＜糊精＝可溶性淀粉＜微晶纤维素＜冻干粉＜羧甲基淀粉钠,平衡吸湿率依次为滑石粉＜糊精＜微晶纤维素＜可溶性淀粉＜冻干粉＜羧甲基淀粉钠,可知羧甲基淀粉钠的吸湿加速度和平衡吸湿率均较大,而滑石粉两者均较小,与图5 一致。

表2 5 种辅料对纳米混悬剂冻干粉吸湿性的影响Tab.2 Effects of five excipients on the hygroscopicity of nanosuspension lyophilized powder

3 讨论

纳米混悬液是近年来针对难溶性药物开发的一种新型制剂形式,由于它属于热力学与动力学不稳定体系,因此要将其固化［12］,常用的固化技术有喷雾干燥［13］、 真空干燥［14］、 冷冻干燥［15］等, 本实验选择冷冻干燥制备复水效果较好的黄芩总黄酮纳米混悬剂冻干粉。但在干燥过程中发现,由于冻结应力与低温应力的存在, 会发生 “冻干损伤”［16］,导致冻干粉粒径增大,故开发安全低毒或药辅合用的新型冻干保护剂具有重大意义。

然后,通过DSC、FT-IR、XRD 对纳米混悬剂冻干粉的理化性质进行表征。DSC、XRD 显示,黄芩总黄酮在冻干粉中呈无定形高度分散,药物结晶度与其饱和溶解度呈负相关［17］,无定形纳米粒促进了药物溶出；FT-IR 显示,黄芩总黄酮与载体之间无相互作用,不影响其药效发挥。

纳米混悬剂冻干粉作为一种制剂中间体,通常要加入不同辅料制成相应制剂,才能应用于临床,同时它作为粉体,流动性好时有利于减少装量差异［18］。吴超群等［19］通过高湿实验发现,纳米混悬剂冻干粉分别在相对湿度75%、92.5%下有吸湿增重、严重结块现象,故选择辅料时不仅要考虑对冻干粉粉体学性质的影响,还要关注其吸湿性。目前,尚无不同辅料对纳米混悬剂冻干粉性质影响的报道,本实验选择常用的5 种辅料(滑石粉、糊精、可溶性淀粉、羧甲基淀粉钠、微晶纤维素)对冻干粉休止角、堆密度、振实密度、溶出度、吸湿性进行研究,可为黄芩总黄酮相关制剂开发中辅料筛选提供可靠的实验依据和理论支持。