去氢骆驼蓬碱聚乳酸纳米粒的制备及其药动学行为

尚慧杰, 阮晓东, 陈晓峰

(1.郑州澍青医学高等专科学校, 河南 郑州450064； 2.上海雷允上药业有限公司技术中心,上海201401)

骆驼蓬Peganum harmala L.为蒺藜科骆驼蓬属多年生草本植物,去氢骆驼蓬碱是其主要活性成分之一,具有提高免疫、辐射防护、抗菌、抗肿瘤、中枢兴奋等药理作用［1-2］,但该成分水溶性很差,生物利用度低下［3］。因此,有必要采用制剂新技术来解决这一问题,推进它在临床上的应用。

聚乳酸是一种可生物降解的聚合物,体内最终代谢成二氧化碳和水,被美国、德国等国家批准用于药用和医用材料。纳米给药系统是指采用高分子材料作为载体制备的胶体微粒,粒径＜1 000 nm,可增加难溶性药物溶解度,降低毒副作用,促进药物吸收,实现被动靶向［4-7］。本实验制备去氢骆驼蓬碱聚乳酸纳米粒,对其体外基本性质进行初步研究,并考察其药动学行为,为该成分开发利用提供参考。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；AR2140 型电子天平［梅特勒-托利多仪器(上海) 有限公司］； VORTEX-5 型涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；JY92-II 型超声仪(宁波新知科仪器研究所)；YC-1200 型台式冷冻干燥机 (北京亚星仪科科技发展有限公司)；Master-sizer 型粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)；MD200-2 型氮气吹扫仪(杭州奥威仪器有限公司)；。

去氢骆驼蓬碱对照品(批号20170115,南京泽朗医药科技有限公司,含有量＞98%)。聚乳酸(分子量15 000,批号2016081715,山东岱罡科技有限公司)；Poloxamer 188(德国巴斯夫公司,含有量＞98%)。 甲醇为色谱纯； 其他试剂均为分析纯。

SD 大鼠,雌雄兼具,体质量 (300±20) g,购自上海斯莱克实验动物有限公司,许可证号SCXK(沪)2012-0002。

2 方法与结果

2.1 去氢骆驼蓬碱含有量测定

2.1.1 色谱条件 Waters C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相甲醇-0.2%甲酸(55 ∶45)；检测波长248 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量20 μL。

2.1.2 线性关系考察 精密称取去氢骆驼蓬碱对照品10.0 mg,置于10 mL 量瓶中,加入适量甲醇超声溶解,室温下放置40 min 后甲醇定容,精密量取适量, 甲醇稀释成20.0、10.0、5.0、0.5、0.05 μg/mL,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以峰面积(Y) 对溶液质量浓度(X) 进行回归,得方程为Y＝1.212 4X+0.009 3(r＝0.999 9),在0.05～20.0 μg/mL 范围内呈良好的线性关系。

2.1.3 方法学考察 取0.05、5.0、20.0 μg/mL对照品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定5 次,测得3 种质量浓度下日内精密度RSD 分别为0.43%、0.19%、0.17%,日间精密度(连续测定5 d, 每天1 次) RSD 分别为0.82%、 0.37%、0.15%。取空白纳米粒混悬液或1.0%十二烷基硫酸钠水溶液1 mL,加入0.5、5.0、20.0 μg/mL 对照品溶液各1 mL,测得去氢骆驼蓬碱平均加样回收率为99.71%,RSD 小于1.76%。

2.2 聚乳酸纳米粒制备 精密称取去氢骆驼蓬碱20 mg、聚乳酸160 mg,溶于25 mL 丙酮-乙醇等比例混合溶液中,注射器缓慢加到50 mL 含0.25%Poloxamer 188 的水相中,超声10 min,减压旋蒸除去有机溶剂,浓缩,离心60 min(25 000 r/min),沉淀物用蒸馏水洗涤后定容至10 mL,以5%甘露醇为冻干保护剂,-70 ℃下预冻48 h,挂入冷冻干燥机中制备,即得,以去氢骆驼蓬碱计,含有量为2.88%。同法制备空白聚乳酸纳米粒。

2.3 粒径、PDI、Zeta 电位测定 取聚乳酸纳米粒冻干前混悬液,蒸馏水适当稀释后放入比色池中,测定粒径、PDI、Zeta 电位,结果见图1 ～2。聚乳酸纳米粒粒径分布在100 ～450 nm 之间,平均粒径为 (195.38±2.02) nm, PDI 为 (0.131±0.034),Zeta 电位为(-19.48±0.36) mV。

图1 聚乳酸纳米粒粒径分布Fig.1 Particle size distribution of polylactic acid nanoparticles

图2 聚乳酸纳米粒Zeta 电位Fig.2 Zeta potential of polylactic acid nanoparticles

2.4 包封率、载药量测定 取“2.2” 项下聚乳酸纳米粒冻干前混悬液1.0 mL,25 000 r/min 离心60 min,取上清液,按“2.1” 项下方法测定去氢骆驼蓬碱含有量(W1)；另取聚乳酸纳米粒混悬液1.0 mL,加入约7 mL 甲醇超声后定容至10 mL,0.22 μm 微孔滤膜过滤,测定去氢骆驼蓬碱总含有量(W0),计算包封率、载药量,公式分别为包封率＝ ［(W0-W1) /W0］ ×100%、载药量＝ ［(W0-W1) /Wt］ ×100% (Wt为聚乳酸纳米粒总质量),测得两者分别为 (76.37±1.08)%、 (8.81±0.25)%。

2.5 体外释药行为研究 1.0%十二烷基硫酸钠溶液制备去氢骆驼蓬碱、聚乳酸纳米粒冻干粉混悬液(以去氢骆驼蓬碱计,含有量为2 mg)、含2 mg 去氢骆驼蓬碱混悬液各2 mL,置于透析袋中,两端扎紧,以1.0%十二烷基硫酸钠水溶液为溶出介质,体积100 mL, 转速100 r/min, 温度 (37±1)℃,于0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24 h 各取样1.0 mL,同时补加1.0 mL空白释放介质,按“2.1” 项下方法测定药物含有量,计算各时间点累积释放度,绘制释药曲线,结果见图3。由图可知,去氢骆驼蓬碱在2.5 h 内即基本释放完毕；其聚乳酸纳米粒体外释药分为2 个阶段,在前8 h 内为快速释药期,8 h 后则为缓慢释药期,24 h 内累积释放度为82.17%。然后,通过一级模型、Higuchi 模型、Weibull 模型等对释药行为进行拟合,发现释药过程更符合Weibull 模型(r＝0.985 7)。

图3 样品体外释放曲线Fig.3 In vitro release curves for samples

2.6 药动学行为研究

2.6.1 对照品、内标溶液制备 取“2.1” 项下0.5 μg/mL 对 照 品 溶 液, 稀 释 成20.0、 50.0、100.0、250.0、500.0 ng/mL,即得。精密称取替硝唑10.40 mg,置于10 mL 量瓶中,8 mL 甲醇超声溶解,冷却至室温后甲醇定容至刻度并逐步稀释,即得(520 ng/mL)。

2.6.2 血浆样品处理［3,8］精密量取血浆样品200 μL于离心管中,同时加入20 μL 内标溶液,饱和NaCO3碱化,加入4.0 mL 乙酸乙酯振荡混匀3 min,10 000 r/min 离心6 min,转移上清液至另一离心管中,40 ℃氮气缓慢吹去有机溶剂,残渣加入200 μL 甲醇溶解,10 000 r/min 离心6 min,在“2.1” 项色谱条件下进样测定。

2.6.3 专属性考察 取空白血浆、血浆对照品溶液(20.0 ng/mL)、给药12 h 后血浆样品适量,按“2.6.2” 项下方法处理,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图4。由图可知,空白血浆内源性物质不干扰测定,去氢骆驼蓬碱和内标分离度良好。

图4 去氢骆驼蓬碱HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of harmine

2.6.4 方法学考察 取“2.6.1” 项下去氢骆驼蓬碱血浆样品,按“2.6.2” 项下方法处理,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,以去氢骆驼蓬碱与替硝唑峰面积比值(Y) 对去氢骆驼蓬碱质量浓度(X) 进行回归,得方程为Y ＝0.038 1X+0.010 9(r ＝0.999 0),在20.0 ～500.0 ng/mL 范围内呈现良好的线性关系。20.0、250.0、500.0 ng/mL 对照品溶液日内精密度RSD 分别为5.09%、3.37%、3.97%,日间精密度(连续测定5 d,每天1 次)RSD 分别为8.82%、 5.17%、 6.44%。 取20.0、250.0、500.0 ng/mL 对照品溶液各200 μL,氮气吹除有机溶剂后,加入200 μL 空白大鼠血浆,按“2.6.2”项下方法处理,测得3 种质量浓度下平均加样回收率分别为90.68%、96.06%、102.18%,RSD＜8.52%。于0、1、2、3、4 d 测定去氢骆驼蓬碱血浆样品,发现在冷冻保存条件下,去氢骆驼蓬碱与内标峰面积比值无显著变化(P＞0.05)。

2.6.5 给药方案及样品采集 取去氢骆驼蓬碱适量,0.5%CMC-Na 溶液配制成20 mg/mL 混悬液；另取聚乳酸纳米粒冻干粉适量,蒸馏水配制成同等浓度混悬液,作为灌胃液,备用。取大鼠12 只,实验室环境中适应1 d,其间禁食不禁水,然后随机分为2 组,按40 mg/kg 剂量分别灌胃给予去氢骆驼蓬碱、 聚乳酸纳米粒混悬液, 于0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 眼眶采血各约0.3 mL, 置于肝素化离心管中,4 000 r/min下离心3 min,小心分取上层血浆,置于另一空白离心管中,-20 ℃冰箱中保存待测。

2.6.6 药动学行为研究 大鼠灌胃给予去氢骆驼蓬碱及其聚乳酸纳米粒混悬液后,测定不同时间点血浆中去氢骆驼蓬碱血药浓度,绘制血药浓度-时间曲线,结果见图5、表1。由此可知,聚乳酸纳米粒Tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞显著高于去氢骆驼蓬碱(P＜0.05,P＜0.01)。

图5 样品血药浓度-时间曲线Fig.5 Plasma concentration-time curves for samples

表1 样品主要药动学参数n=6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for sampless，n=6）

表1 样品主要药动学参数n=6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for sampless，n=6）

注：与去氢骆驼蓬碱比较,*P＜0.05,**P＜0.01

参数 单位 去氢骆驼蓬碱 聚乳酸纳米粒TC mmaaxx ng·m h L-1 22 13..41 38± ±03.0 2.87 4 50 28..03 83± ±09.1 4.0 67***AUC0～t ng·mL-1·h 1 413.78±211.93 3 256.41±379.05**AUC0～∞ ng·mL-1·h 1 504.48±240.86 3 393.65±423.72**

3 讨论

本实验制备的去氢骆驼蓬碱聚乳酸纳米粒粒径较小,分布均匀,可能是由于溶解药物、载体的丙酮和乙醇可在水相中迅速扩散,易得到较小的粒径［9-10］；水相中表面活性剂对纳米粒具有稳定作用,不易发生粘连,平均粒径为(195.38±2.02)nm,而冻干后虽增加至(203.28±3.94) nm,但粒径变化无显著差异(P＞0.05)。另外,混合溶剂乙醇与丙酮的比例不可过高,以防聚乳酸析出；水相中表面活性剂浓度也不宜太高,防止增溶作用使去氢骆驼蓬碱溶于水相,从而降低包封率、载药量,经前期预实验考察,最终选择0.25%。

处理去氢骆驼蓬碱血浆样品时,先加入碱性物质NaCO3使待测组分游离出来,再用有机溶剂乙酸乙酯进行萃取,该方法精密度、回收率等均符合2015 年版《中国药典》 四部9012 项下生物样品定量分析方法学验证指导原则的规定。药动学行为研究结果显示,聚乳酸纳米粒可显著提高去氢骆驼蓬碱Cmax和AUC0～t,其原因可能是聚乳酸纳米技术可明显增加药物分散性和比表面积,从而提高与胃肠道黏膜的接触面积；纳米粒易吸附在胃肠道黏膜,有助于药物充分吸收,同时可在胃肠道具有淋巴结构的派伊尔淋巴集结中聚集,通过M 细胞进入体循环而促进药物吸收。测定体外释放度时发现,聚乳酸纳米粒释放速度明显慢于去氢骆驼蓬碱,但两者Tmax相差不大,这可能是由于纳米粒可在较短时间内经消化道直接吸收进入体循环［11］,主要途径为消化道上皮细胞直接吸收,或通过派伊尔淋巴集结和上皮细胞吸收,其相对生物利用度是后者的2.30 倍,有助于充分发挥药理作用［9,12-13］。今后,将进行去氢骆驼蓬碱聚乳酸纳米粒的药效学研究, 以期为进一步研发提供更完整的实验数据［14］。