基因突变状态与肿瘤相关性静脉血栓关系的研究进展

张亚培 张雪 综述 姜达 审校

肿瘤相关性静脉血栓栓塞疾病（venous thromboembolic disease，VTE）为癌症患者中常见且危及生命的并发症之一。VTE 包含深静脉血栓（deep venous thrombosis，DVT）和肺栓塞（pulmonary embolism，PE）。癌症患者血栓的形成往往提示预后不良，并且严重影响患者的生存质量。因此，早期个体化预防治疗对于防治癌性血栓显得尤为重要。在精准医疗的时代背景下，基因检测已成为临床诊疗过程中的一部分，在分子水平方面，大数据分析能力的快速提高，使得深入探索基因突变状态与肿瘤相关性VTE 之间的关联性成为可能。

1 基因突变状态预测肺癌患者发生肿瘤相关性VTE的风险

肺癌为引起肿瘤相关性VTE发生率最高的癌种之一。与其他类型肺癌相比，肺腺癌发生VTE 的风险较高［1-3］。因此，研究肺癌患者基因突变状态发生VTE风险之间的联系具有重要意义。

1.1 EGFR基因突变与VTE的研究

Elise等［4］报道3例确诊为肺腺癌的VTE患者，其中2例存在EGFR突变，在随后应用化疗及靶向治疗过程中出现了下肢疼痛症状，经多普勒超声检查确诊为静脉血栓。1例因下肢疼痛就诊发现肺腺癌EGFR基因突变。由此，研究人员认为肺腺癌患者中存在EGFR突变可能为VTE的预测指标。Lee等［5］研究1 998例非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者中，其危险因素、预后影响及评估特定基因突变与VTE风险之间的关系，结果发现突变患者与未突变患者之间未发现显著差异，EGFR突变（P=0.170）和ALK重排（P=0.159）与肺腺癌VTE的发生无关。另一项对照研究收集159例NSCLC患者信息，其中57例存在VTE，对159例患者的石蜡包埋的肿瘤块采用实时聚合酶链反应法（polymerase chain reaction，PCR）检测EGFR基因21外显子中的L858R点突变，分析EGFR基因突变状态与VTE发生风险之间的联系，结果发现EGFR突变组和未突变组的VTE发生率无显著差异（OR=0.99，95%CI：0.27～3.48；P=0.990）［6］。另一项回顾性研究旨在评估ⅢB～Ⅳ期肺腺癌患者CT扫描检测PE的发生率，评估癌基因突变状态与PE风险之间的潜在相关性，该研究纳入173例肺腺癌患者，对PE存在进行判断的同时收集患者的致癌基因驱动因子（EGFR、KRAS或ALK）的数据，结果发现31例EGFR突变患者中5例发生PE，未发现PE发生风险与EGFR突变有关［7］。但是Davidsson等［8］一项回顾性研究，对310 例肺腺癌患者，根据其突变状态（EGFR、ALK突变和未突变）分为3个亚组，使用基于突变状态和接受治疗的Cox回归分析评估VTE的无事件时间，从而探究EGFR和ALK基因突变状态对肺腺癌VTE风险的作用，结果显示EGFR基因突变与VTE风险降低相关（HR=0.46，95%CI：0.23～0.94）。为进一步研究EGFR与NSCLC患者VTE发生之间的临床相关性，一项前瞻性研究［9］由此展开，该研究纳入605例中国NSCLC患者，其中244例（40.3%）发生EGFR突变。在多变量分析中，EGFR野生型（OR=1.81，95%CI：1.07～3.07）与VTE风险增加相关。在竞争性风险分析中，有EGFR突变的患者在1年后发生VTE的概率为8.3%，无EGFR突变的患者为13.2%；2年后相应的概率分别为9.7%和15.5%（P=0.047）。结果表明，EGFR突变可降低NSCLC患者VTE的发生风险。目前，关于两者的研究结果不一致，EGFR基因突变状态与VTE发生风险之间的关系尚未可知，亟需开展大规模前瞻性研究，阐明EGFR基因突变与VTE之间的联系。

1.2 KRAS基因与VTE的研究

有研究收集了159例NSCLC患者信息，其中57例患者存在VTE，对这159例患者的石蜡包埋的肿瘤块利用BstN1和Hae Ⅲ技术对KRAS基因突变型和野生型进行限制性片段长度多态性分析，结果显示KRAS突变与该NSCLC队列中VTE风险增加有关（OR=2.67，95%CI：1.12～6.42；P=0.014）［6］。但是另外一项回顾性研究［7］并未得出相同结果，该研究纳入173例肺腺癌患者，评估癌基因突变状态与PE风险之间是否存在潜在相关性，结果发现27例KRAS突变患者中5例发生PE事件，结果未发现PE发生风险与KRAS突变有关。上述均为回顾性研究，在一项前瞻性研究中［9］，纳入605例初诊为NSCLC的患者，随访时间最长为4.5年，在62例KRAS突变型患者中，有10例（16.1%）发生VTE，而543例KRAS野生型患者中有61例（11.2%）发生VTE。1年后，KRAS突变型患者发生VTE的概率为16.1%，而KRAS野生型患者发生VTE的概率为10.6%；2年后，相应的发生率分别为18.8%和12.4%（P=0.180）。在包括年龄、性别、肿瘤组织学、肿瘤分期、表现状态、EGFR和KRAS基因状态的多变量分析中，KRAS突变与VTE风险无显著相关性（P＞0.05）。关于KRAS基因突变与VTE之间的关系目前研究结果不一致，仍缺乏相关数据证明两者之间的确切关系。

1.3 ALK基因重排与VTE的研究

ALK基因重排在肺腺癌患者中的发生率为3%～5%［10］。有研究发现，ALK 基因重排与肺腺癌VTE 的发生无关（P=0.159）［5］。同样，在另外一项回顾性研究中，结果也并未证实ALK 基因重排与VTE 发生风险之间的关系［8］。ALK 基因重排会增加患者VTE 发生的风险，有回顾性研究收集了55 例诊断为ALK 阳性的NSCLC患者，中位随访22个月，VTE的发生率为42%，同时在以色列两个3 级中心接受治疗的43 例NSCLC患者的验证队列中，中位随访13个月后，VTE的发生率为28%，该研究认为存在ALK 基因重排的NSCLC 患者发生VTE 的概率较其他NSCLC 患者高3～5倍［11］。一项评估ⅢB～Ⅳ期肺腺癌PE发生率的回顾性研究发现［7］，ALK 基因重排的存在与PE 风险增加有关，该研究共纳入173 例肺腺癌患者，发现17例ALK 重排患者中8 例发生PE，认为ALK 重排增加VTE 发生风险（HR=2.06，95%CI：1.08～3.55）。ALK基因重排与VTE 之间的关系各项研究目前尚无定论，亟需进一步探索两者之间的内在联系及机制，从而为临床提供依据。

1.4 ROS1基因融合与VTE的研究

ROS1基因融合发生在1%～2%的NSCLC中［12］，在临床上与从不吸烟、年龄较小和腺癌组织学相关。有研究提示［13］，晚期ROS1 基因融合的NSCLC（ROS1+NSCLC）具有高于预期的血栓栓塞事件（thromboembolic event，TEE）发生率，该研究纳入2002年10月至2018年4月美国和中国5个学术中心诊断出的ROS1（+）、ALK（+）、EGFR（+）或KRAS（+）的晚期NSCLC患者740例，主要终点是在确诊90天内各组的TEE的发生率。结果表明，ROS1（+）、ALK（+）、EGFR（+）和KRAS（+）TEE的发生率分别为34.7%（33/95）、22.3%（43/193）、13.7%（41/300）和18.4%（28/152）。在单变量分析中，（ROS1+NSCLC）队列中TEE的发生率高于ALK（+）、EGFR（+）和KRAS（+）队列。在多变量分析中，与EGFR（+）和KRAS（+）队列相比，ROS1（+）的TEE发生率更显著（OR=2.44，95%CI：1.31～4.57；P=0.005和OR=2.62，95%CI：1.26～5.46；P=0.01）。但与ALK（+）相比，ROS1（+）的TEE发生率差异无统计学意义（OR=1.45，P=0.229）。与EGFR（+）和KRAS（+）队列组相比，晚期ROS（+）NSCLC患者的TEE发生风险明显升高。ALK（+）NSCLC的TEE发生风险也可能同样升高。关于ROS1基因突变与VTE发生风险关系的相关研究较少。目前，暂无结论认为ROS1基因突变增加肺癌患者TEE发生风险。

2 基因突变状态预测结直肠癌患者发生VTE的风险

2.1 KRAS基因与VTE的研究

KRAS 是Kirsten 大鼠肉瘤-2 病毒致癌基因的人类同源物，是一种调节增殖、分化和细胞存活的GTP酶信号蛋白。密码子12 和13 的突变导致GTP 酶活性降低，从而导致下游信号通路异常活跃［14］。这种突变在约30%～50%转移性结直肠癌（metastatic colon cancer，mCRC）患者中发现，在其他肿瘤类型中也较为常见［15］。KRAS 基因突变状态为一种比较确定的预测生物标志物，目前用于确定那些可能不会从抗EGFR治疗中获益的mCRC患者。有研究表明，结直肠癌细胞表面的正常组织因子（tissue factor，TF）表达通过KRAS 致癌基因突变和TP53（tumor antigen p53，TP53）抑癌基因失活而上调，这两种突变均为癌症进展中的主要转化事件［16］。

有研究发现，KRAS基因突变增加mCRC患者的VTE风险［17］。该研究对2002年1月至2013年9月3个不同地点报告的KRAS状态的CRC患者病理报告及临床资料进行了多中心回顾性分析。共172例符合研究条件的患者入组，其中KRAS突变患者65例，KRAS野生型患者107例，KRAS突变患者的VTE和DVT发生率分别为32.3%和23.1%。野生型KRAS患者的相应发生率分别为17.8%和9.4%。风险比分别为VTE：OR=2.21，95%CI：1.08～4.53；DVT：OR=2.62，95%CI：1.12～6.12。对Khorana评分和贝伐珠单抗注射液的使用进行调整后，其关联仍然显著，结果提示KRAS突变与mCRC患者的VTE发生风险增加有关。

2.2 整合素β3基因与VTE的研究

整合素β3参与肿瘤内皮细胞生物学以及血小板聚集。在一项研究中［18］，旨在评估整合素β3 基因（rs3809865、rs5918 和rs4642）中3 种种系单核苷酸多态 性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）预 测CRC 患者中VTE 发生的风险，在112 例CRC 患者中，VTE发生率为12%。该研究发现，SNPrs5918基因和rs4642基因与VTE发生风险无关。对于rs3809565基因，23%患者具有A/A基因型，4%患者具有A/T基因型，但无患者具有T/T基因型。在单变量分析中，与其他多态性相比，具有A/A 基因型的患者发生VTE的风险显著升高（P=0.000 5）。在多变量分析中，预测值仍然较为显著。由此该研究认为，具有β3-整联蛋白rs3809865 A/A 基因型的CRC 患者与具有A/T 或T/T基因型的CRC 患者相比，VTE 发生风险会增加。虽然这种基因变异与癌症相关性血栓（cancer-associated thrombosis，CAT）之间的因果关系仍然未知，但该研究推测这种变异可能导致β3 整合素的表达增加，因为这种基因型对microRNA介导的下调不敏感。目前，尚缺乏rs3809865 A/A 依赖性β3-整联蛋白在内皮细胞和血小板上表达的研究。此外，具有该基因型的非癌症患者的VTE 风险尚未明确。因此，虽然可能推测β3-整合素rs3809865 A/A与癌症患者VTE风险增加之间存在联系，但这一假设尚无法得到证实［19］。

3 脑胶质瘤患者中异柠檬酸脱氢酶1 或2 状态与VTE发生风险的研究

侵袭性胶质母细胞瘤常常含有脑胶质瘤患者中异柠檬酸脱氢酶1 或2（isocitrate dehydrogenase 1/2，IDH1/2）的野生型变体，而IDH1/2的体细胞点突变与侵袭性行为和坏死较少有关［20-21］。有研究［22］调查了野生型IDH1/2胶质母细胞瘤患者是否更有可能发生VTE。队列组和验证队列组分别有169例和148例患者，携带IDH1/2 突变的患者无论是在队列中还是在验证队列中均未发生静脉血栓栓塞。此外，IDH1/2突变的胶质瘤仅2%显示瘤内微血栓，而在野生型IDH1/2胶质瘤中瘤内微血栓占86%。该关联可能与肿瘤中TF 表达降低和循环促凝过程中活化的TF 阳性微颗粒（TF-positive microparticles，TF+MPs）有关。一项前瞻性研究表明，IDH1 突变的存在与VTE 发生风险较低相关［23］。在该研究中，在单变量至VTE 发生时间的回归分析中，IDH1 突变预测VTE 风险较低（HR=0.11，95%CI：0.01～0.80；P=0.029），这在胶质母细胞瘤和年龄的多变量分析调整后均得以证实。因此，IDH1/2 突变可能是预测癌症患者VTE 风险降低的一个生物标志物（表1）。

表1 既往基因突变状态与肿瘤相关性VTE相关性的临床研究

4 基因突变与肿瘤相关性VTE发生的分子机制

TF又称凝血因子Ⅲ，主要由血管平滑肌细胞、纤维母细胞和外膜细胞构成性表达［24］。生理情况下，TF 通过外源性凝血途径参与体内止血，维持机体的正常功能。无论是癌细胞本身还是与肿瘤相关的宿主细胞（如内皮细胞、巨噬细胞）均存在过表达TF［25］。肿瘤细胞还可能通过组织缺氧使TF 高表达，高表达的TF 通过激发局部或系统的凝血级联反应，引起肿瘤相关性高凝，导致癌症患者血栓形成风险增加［26］。有研究报告了胰腺癌和脑肿瘤中TF水平与VTE 之间的相关性［27-28］。人胰腺癌模型研究显示癌细胞表达TF 并向血液中释放TF+MPs，TF+MPs 是由凋亡细胞或活化细胞产生具有高度促凝作用的小膜囊泡，MPs含有多种表面蛋白，包括TF和磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），上述蛋白使MPs具有促凝活性。单核细胞来源的MPs 主要通过TF 触发凝血，而血小板来源的MPs 通过将PS 暴露在其表面，并以FXII依赖的方式独立于TF和外部通路启动凝血酶生成，从而促进血栓的形成［29］。近年来，有研究发现TF的表达是通过癌基因和抑癌基因控制的，包括EGFR、RAS和TP53等［30］。

4.1 KRAS基因调控TF的表达

在结直肠癌细胞系中的研究证明，TF 上调与活化的突变体KRAS等位基因的表达紧密相关。另外，TF 上调是依赖KRAS 基因的肿瘤发生和血管生成的重要效应器［31-33］。Yu等［32］利用结肠直肠癌细胞系的体外遗传操纵建立了一个理想的模型，在CRC 中KRAS 致癌基因的激活和TP53 的缺失参与TF 调控。由于KRAS 的突变和肿瘤抑制基因TP53 的缺失，TF表达通过丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）信号传导途径上调。该基因改变不仅影响细胞膜上TF 的水平和活性，还影响癌细胞向循环中释放的微泡表面TF的水平和活性。为探讨肿瘤细胞中TF的上调是否会引起全身促凝剂的释放，本研究采用人特异性TF ELISA 检测荷瘤小鼠血浆中TF抗原浓度。发现在肿瘤小鼠体内检测到的所有循环TF 抗原，基本均源于肿瘤细胞衍生的TF。与细胞结合TF一样，游离TF活性的分泌与相应CRC细胞的遗传状态相对应（即K-ras野生/p53野生＜K-ras突变/p53野生＜K-ras突变/p53突变）。这表明，KRAS和TP53不仅影响细胞表面TF的表达，还影响癌细胞释放到周围环境和循环中的TF活性的全局量。TF并不影响结直肠癌细胞系的体外增殖特性。

有研究分析了40例NSCLC肿瘤样本，其中8例样本存在KRAS突变，TF水平显著升高（P＜0.000 1）。TF的过表达导致肿瘤患者血栓形成风险增加［34］。因此，肺癌标本中存在KRAS突变可能与较高的血栓形成风险相关。

4.2 EGFR基因调控TF的表达

在癌症中，TF经常被外部刺激和致癌突变上调，如EGFR突变［35］。EGFR上调癌细胞表面的TF，并触发含有TF的微泡释放进入荷瘤小鼠循环。由此产生的反应与癌症相关血栓形成、血管生成、转移和肿瘤发生等事件有关［32］。一项研究分析了U373恶性胶质瘤细胞及其表达EGFRⅧ（U373Ⅷ）的变异，以及内源性表达致癌EGFR的A431鳞癌细胞［36］。U373Ⅷ和A431细胞在SCID小鼠中的生长均依赖于致癌EGFR。在研究中，U373细胞为惰性细胞并且表达极低水平TF。相反，其表达EGFRⅧ的同基因对应物（U373Ⅷ）产生大量的TF转录物和蛋白质，两者均可以被EGFR的药理学抑制剂所抑制。A431细胞组成型表达TF蛋白、转录物和启动子活性，并且可以通过EGFR激动剂导致TF表达增加，EGFR抑制剂导致TF表达降低。结果表明，致癌/突变EGFR在不同类型的癌细胞中均上调TF，再次支持了癌基因与止血激活之间的直接联系。

4.3 IDH1/2与血栓形成关系的内在联系

在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中，针对神经胶质瘤等级和IDH1/2状态检查35种凝血相关基因的mRNA水平。发现在促凝血基因中，TF与肿瘤IDH1/2突变状态呈最强的反向关联，TF的平均转录水平在所有肿瘤等级的突变体胶质瘤中降低75%［19］。TF是一种膜结合受体，在其膜结合形式中引发凝结。突变体IDH1/2通过诱导超甲基化［37］，导致TF mRNA转录和TF蛋白表达降低。因此，有研究分析了TF TCGA胶质瘤中的启动子甲基化，在TF启动子中的17个CpG位点中和所有神经胶质瘤等级中，与野生型肿瘤相比，8个在IDH1/2突变肿瘤中具有更高水平的甲基化［19］。与野生型胶质瘤相比，IDH1/2突变体胶质瘤中的TF免疫反应性较低，与TCGA中TF mRNA数据相一致。在野生型胶质瘤中存在更大范围的TF表达，并且低TF 表达与较长的生存期相关（HR=2.0，95%CI：0.99～4.00；P=0.049）［38］。而另一种潜在机制为新型、快速、钙依赖性的D-2-HG对人血小板聚集和凝血的抑制作用。突变型IDH1/2胶质瘤的匀浆中含有高达30 mm的D-2-HG，表达突变型IDH1的细胞将D-2-HG释放到培养基中［39］。表达R132H IDH1的异种胶质瘤在宿主小鼠尾部剪切后显示出减少的凝血，提示完整的肿瘤可释放足够的D-2-HG影响凝血。值得注意的是，模型中R132H IDH1并未改变U87MG细胞中TF的表达，也未显著改变外周循环TF微泡的活性。该模型为专门研究R132H IDH1对体内血小板活性的影响，不是TF表达和血栓的形成。在血脑屏障破坏并且最有利于血栓形成的高级别胶质瘤中，D-2-HG可进入血液并对肿瘤血管床内的血小板聚集发挥局部抑制作用，从而降低血栓发生率。然而，突变型IDH1/2胶质瘤仅在患者血清中达到低微摩尔浓度的D-2-HG［40］。因此，外周血小板活性和凝血功能不会受到显著影响。

5 结语与展望

近年来，肿瘤相关性VTE的发生越来越受到关注，其相关预防、治疗已被列入诸多指南中，且多种风险评估工具已被开发。随着精准医疗的发展和基因检测技术的推广普及，分子数据在肿瘤患者临床预后和治疗决策方面均发挥重要作用，并且VTE风险前瞻性模型也可以利用上述信息开发。到目前为止，结直肠癌和肺癌中KRAS突变被认为与VTE风险增加有关，肺癌中ROS1、ALK融合突变被认为与VTE风险增加有关，EGFR突变与VTE风险降低有关，而IDH1/2突变与胶质母细胞瘤患者的VTE风险降低有关。但其机制尚未明确，肿瘤相关性VTE形成中心的蛋白质为TF，其在肿瘤进展和静脉血栓形成中均发挥作用，而KRAS、EGFR和IDH1/2的突变均参与TF调控。在体外遗传操纵模型中，驱动基因KRAS、EGFR的突变不仅上调癌细胞表面的TF，而且触发含有TF的微泡释放进入荷瘤小鼠循环，从而影响凝血功能。EGFR突变使TF上调，与EGFR突变和VTE风险降低有关，亟需大量研究进一步探索其潜在联系。而IDH1/2 突变通过诱导超甲基化，导致TF mRNA转录和TF蛋白表达降低，另一种潜在机制为突变型IDH1/2胶质瘤的匀浆中含有较高的D-2-HG，其对人血小板聚集和凝血具有抑制作用，从而降低VTE发生风险。目前，亟需进一步研究每个基因在VTE中的作用，并逐一寻找与VTE相关的基因，多方法、全方位地探究基因与VTE之间的发生机制，从而开发新型生物标志物，提高VTE预测模型的准确性。