小鼠胰腺癌肝转移模型及相关分子表达的研究

刘玉美 李婷 杨秀疆

胰腺癌恶性程度高、发现晚，晚期常伴有高发的肝转移而预后不佳，目前在西方国家肿瘤相关死亡中居第4位［1］。为研究胰腺癌的发病及转移机制、验证新型化疗方案的可行性和有效性，需要进行大量的体内外实验研究或临床试验。其中体内实验应用相关动物模型模拟人类肿瘤环境，从而进行肿瘤相关研究。建立适宜的胰腺癌动物模型，可以为深入研究胰腺癌的发生发展、侵袭转移机制以及寻找新的治疗策略提供有效的手段。小体积的脾内和胰腺内注射法是自发肝转移模型的理想选择，用于研究调控胰腺癌肝转移的机制。胰腺内注射法属于原位移植模型，因肝脏转移瘤形成所需时间长造成荷瘤生存周期长，4 周左右才可形成胰腺原位瘤，培养期间动物的死亡率较高，因而肝转移成瘤率并不高。1984年，Kozlowski 等［2］首次采用脾脏内移植瘤细胞的方法建立肝转移模型，该方法具有培养时间短、转移瘤形成率高、符合血行转移途径的优势，4 周左右即可形成肝脏转移瘤，很快被用于结肠癌和胃癌等消化系统恶性肿瘤的肝转移模型研究。根据已有文献检索，国内目前罕有经脾注射鼠Panc-2 细胞来建立胰腺癌肝转移动物模型的报道，本文尝试建立胰腺癌经脾肝转移动物模型，为胰腺癌肝转移生物学行为的研究以及抗肿瘤药物的筛选提供一个体内实验环境，并对部分转移相关分子的基因表达水平的变化进行初步研究，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物和细胞株 18 只5 周龄，体质量为16～18 g的C57/BL6小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，均置于SPF环境下饲养。鼠胰腺癌Panc-2细胞株（获赠于日本金沢大学Mukaida Naofumi教授）（Panc-2 源自于胰腺癌导管细胞，能在裸鼠上成瘤，属于胰腺低分化腺癌，侵袭力较强，容易制造移植和转移模型）。

1.1.2 主要材料和试剂 RPMI 1640 培养基购自英国Biosera；TRIzol 试剂盒购自美国Invitrogen 公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒购于日本TaKaRa BIO INC；SYBR Premix Ex TaqTM 购于日本TaKaRa BIO INC；PCR 引物购于上海华津生物科技有限公司；美国ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System，等。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 本研究获得复旦大学动物伦理委员会审批，所有实验动物均按照国家卫生研究所的实验室动物福利伦理指南进行。选择处于对数生长期的Panc-2 细胞，以PBS 重悬，配制成瘤细胞悬液，调整细胞浓度为1×107/mL，锥虫蓝染色证实细胞活力在98%以上。腹腔注射麻醉成功后，小鼠取仰卧位，用0.5%的碘伏消毒。取左上腹纵行切口，长1.0 cm左右，进腹显露脾脏，将其轻轻拖出腹腔外，脾下极进针约1.0 cm，用无齿镊夹持住脾脏下极的中部（注射针尖略向后方），实验组12只小鼠分别缓慢注入瘤细胞悬液50 μL（总计5×105个肿瘤细胞），可见脾包膜迅速鼓起、变白。注射结束，待脾脏颜色转红，快速拔针，迅速用碘伏棉球压迫针眼至少5 min，然后将脾脏送回，全层关腹。采用同样的操作方法，将对照组6 只小鼠注射等量的PBS 缓冲液。术后小鼠常规喂养。待小鼠培养4周时，颈椎脱臼法处死并解剖小鼠，观察脾脏成瘤情况、腹腔内有无肝脏转移以及其他部位转移。取脾脏移植瘤和肝脏转移瘤组织，行苏木精-伊红（H＆E）染色，常规病理学检查。并留取部分脾脏移植瘤体组织、肝脏转移灶及其配对癌旁组织放置于-80℃冰箱保存（癌旁组织，通常是指病变部位旁2 cm 之内的组织区域，结合小鼠肝脏体积较小，本文描述的肝转移灶癌旁组织均取自肝转移灶旁0.5～1 cm之内的肝组织。）。

1.2.2 转移相关因子的基因表达水平检测 首先采用Trizol 法（参考Invitrogen TRIzol 试剂使用说明书）分别提取脾脏移植瘤组织、肝转移瘤组织以及肝转移瘤灶旁肝组织总RNA，再进行反转录PCR（TaKa-Ra PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒），将获得的cDNA 进行qRT-PCR，选用SYBR Premix Ex TaqTM 试剂，按照两步法进行［3-4］。最后使用软件RQ manager 1.2.1 进行数据分析，得出相关分子的基因在不同组织中的表达fold change值，进行统计学分析。

1.3 统计学方法

用GraphPad Prism 5.0 及SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料采用x±s表示，样本间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型构建

实验组1只小鼠在第4周死亡，尸检发现该小鼠出现肝脏转移伴腹膜多发转移，余11只小鼠活力减弱，遂终止实验。实验组12只小鼠中10只出现肝脏转移瘤，总体的肝脏成瘤率为83.33%，解剖发现：12只小鼠腹腔内均见有较多的血性腹水，脾脏均于注射部位出现单一的种植瘤结节；其中10只肝脏表面及切面见有大小不等的灰黄色病灶，弥散分布，部分融合成块；此外，除死亡的1只小鼠腹腔内见多发灰白色小结节，余11只小鼠均未见明显腹膜结节形成。肝脏病灶行病理学检查，镜下见部分组织呈实性片状生长，少数有腺管形成，细胞体积大，核大、深染，异型明显，可见小核仁，核分裂相多见，间质少，体积较大的病灶中央多可见片状坏死钙化灶，坏死区内可见细胞肿胀，细胞核染色质絮状或边集、细胞膜及细胞器膜溶解破裂、细胞自溶等细胞坏死现象，符合胰腺导管腺癌的特征。上述实验结果表明小鼠胰腺癌经脾肝转移模型成功建立。对照组小鼠活动如常，解剖后观察脾脏和肝脏红润，均未见结节形成（图1）。

2.2 胰腺癌肝转移部分转移相关分子的基因表达水平

采用荧光定量PCR的方法比较脾脏移植瘤灶、肝转移灶及转移灶旁的部分与胰腺癌肝转移相关分子的基因表达水平。在软件RQ manager 1.2.1中设定分子在肝脏转移癌旁肝组织的基因表达量为1，则在脾脏移植瘤灶和肝转移灶中的基因相对表达量均大于1的分子有CCL-17、CCL-22、CD44、CXCL-3、CXCL-5、CXCR2、CXCR7、FGF-2、FGF-7、MMP2、MMP3、MMP9、PDGFα、PDGF-β、PDGFR-α、PDGFR-β、TGF-β1、TGF-β3、UPA、UPAR。除CD44外，其余分子在肝转移灶和癌旁肝组织中的表达量有显著差异（P＜0.05），提示这些分子在肝转移灶的基因表达量高于癌旁正常肝组织，对胰腺癌的肝脏转移可能发挥促进作用。基因相对表达量均小于1 的分子有Ang-2、BAK、BAX、E-cad、HGF、ITGA2、ITGB1、VEGF。这些分子在肝转移灶与癌旁肝组织中表达量有显著差异（P＜0.05），提示这些分子在肝转移灶的基因表达量低于癌旁正常肝组织，对胰腺癌的转移具有抑制作用。与脾脏癌组织表达量相比，CCL-17、CXCL-5、FGF-2、MMP3在肝脏转移癌组织表达水平高（P＜0.05），CD44、FGF7、MMP2、Ang-2、E-cad在肝脏转移癌组织表达水平低（P＜0.05），而CCL-22、CXCL-3、CXCR2、CXCR7、MMP9、PDGF-α、PDGF-β、PDGFRα、PDGFR-β、TGF-β1、TGF-β3、UPA、UPAR、BAK、BAX、HGF、ITGA2、ITGB1、VEGF在两者中的表达无显著学差异（P＞0.05，表1，图2）。

图1 动物模型构建

表1 不同组织相关转移分子的基因相对表达情况

表1 不同组织相关转移分子的基因相对表达情况（续表1）

图2 不同组织相关转移分子的基因相对表达量柱形图

3 讨论

癌细胞的侵袭能力是决定癌细胞能够发生肝转移的最关键因素，有效的接种方法也是影响其能否发生转移的重要因素之一。通过肿瘤细胞注射法，使用不同的途径建立胰腺癌肝转移模型，包括血管内注射法［5］、腹腔内注射法、动脉内注射法、脾内注射法、肝内注射法以及胰腺内注射法。胰腺内注射法或者胰腺内瘤组织移植法均属于原位移植模型，因小鼠荷瘤生存周期长，培养期间动物的死亡率较高，因而肝转移成瘤率并不高。脾内注射法具有培养时间短、转移瘤形成率高、符合肿瘤血行转移途径的优势，4 周左右即可形成有效的肝转移病灶。因此，本实验选择了小体积脾内注射法进行建模。

本实验采用的小体积脾内注射法由Kopper 等［6］首次提出，最大程度地模拟了人胰腺癌肝转移过程，是自发肝转移模型的理想选择。该方法的常见并发症是出血和肿瘤细胞渗漏，本实验构建的小鼠模型均无明显出血，仅1只小鼠出现腹腔内多发转移。本实验中，1只小鼠在第4周出现死亡，解剖发现形成肝脏及腹腔内多发转移灶，考虑恶性肿瘤本身影响了小鼠的代谢及生长。此外，2只小鼠仅形成脾脏移植瘤，未出现肝脏转移瘤，考虑与培养周期不够长、未选择高转移胰腺癌细胞系、瘤株活性降低、操作技术误差以及裸鼠内环境影响和瘤细胞的多潜能分化有关。本研究中肝转移成瘤率为83.33%，实验组小鼠数量为12只，仍有待提高，从而进一步验证该方法的有效性与可靠性。近来有文献报道［7］采用表达绿色荧光蛋白的胰腺癌细胞进行胰腺尾部注射，构建胰腺癌原位模型，实现了胰腺癌生长及转移过程非侵入性实时成像，用于研究新型疗法对原发灶和转移灶的治疗效果。

在肿瘤诊断时，胰腺癌患者常已出现浸润周围组织的局部晚期癌灶，或者远处转移［8-9］。肿瘤转移的发生机制包括肿瘤细胞和宿主微环境之间平衡作用调控的多种连续步骤，胰腺癌肝转移的步骤，从理论上说包括转化、增殖、血管生成、侵袭、循环、溢出、肝脏中增殖［10-12］。

在肿瘤的生长、增殖阶段，微环境中的许多分子和相应受体结合，引发一系列细胞效应，促进肿瘤细胞的增殖、转化和迁移。在本实验中，转移癌灶中基因相对表达量高于癌旁肝组织的分子PDGF 及其受体PDGFR、FGF-2［13］的过表达或过度活化，BAK、BAX等促凋亡蛋白的低表达［14-16］，共同促进肿瘤生长。TGF-β在肿瘤发生、发展中具有双重作用：在肿瘤发生的起始阶段TGF-β扮演着肿瘤抑制者的角色，而在进展期TGF-β发挥促进肿瘤细胞浸润转移的作用［17］。

直径＜2 mm 的肿瘤可以通过扩散的方式获得氧和营养，当肿瘤体积增加时，需要建立血管供应［18］，不仅保证了肿瘤扩张的供给，而且为肿瘤细胞提供了血源性传播的渠道。诱导血管生成的过程受控于肿瘤和宿主细胞产生的促进和抑制血管生成的分子［19］，这些分子包括VEGF［20］、碱性成纤维细胞生长因子［21］、IL-8［22］等，均已被证实在胰腺癌中表达。除此之外，PDGF及其受体PDGFR涉及多种肿瘤的发病机制并在血管生成中起重要作用［23］。本研究结果显示VEGF、Ang-2在脾脏癌灶、肝脏转移癌灶中的基因表达水平低于肝转移灶旁肝组织，但根据文献报道，VEGF、Ang-2 在前两者中的基因表达水平高于后者［24］，从而发挥促进肿瘤生长及转移的作用。考虑到肝脏组织血供丰富，肿瘤边缘区血管生成活跃，而肿瘤的中心或内部血管稀疏甚至缺如，胰腺癌本身又是乏血供肿瘤，因此，胰腺癌组织相对肝组织来说，VEGF、Ang-2 的基因相对表达量可能较低，但并不能否认两者对胰腺癌增殖及侵袭的促进作用。

在肿瘤侵袭、转移过程中，可能伴随钙黏素分子下调，特别是E-cadherin、ITGA2、ITGB-1等黏附分子的表达下降，促使肿瘤细胞间黏附力下降，本实验结果与之一致［25-26］。肿瘤侵袭过程得益于增强的细胞运动能力、减弱的黏附力以及Ⅳ型胶原蛋白酶、基质金属蛋白酶MMP2和MMP9、丝氨酸蛋白酶（t-PA、u-PA）等降解酶的分泌，进展更加有利［27-28］。肿瘤的转移是一种非随机的、有组织器官选择性的高度组织化的过程，已有实验证实肿瘤细胞的转移受趋化因子的严格调控［29-30］。在本实验中，CCL-17、CCL-22、CXCL-3等趋化分子的高表达，说明其对肿瘤细胞的转移促进作用，但具体调控机制尚待进一步研究。

肿瘤细胞形成的栓子可以被毛细血管床捕获，诱导内皮反应，通过特异的细胞表面受体整合素、钙黏蛋白和CD44 抗原等，与基底膜上的糖蛋白（如层黏连蛋白）连接［31-32］。紧跟着黏附的过程，肿瘤细胞溢出进入到肝脏实质，肝实质内胰腺肿瘤细胞的增殖受控于生长促进受体和抑制因子的相互作用［33-34］。研究表明［35-36］，HGF-c-met 信号通路参与胰腺癌的浸润、扩散和转移，主要通过肿瘤实质与间质的相互作用。但在本实验中HGF的表达量在癌旁肝组织高于癌组织，其原因可能归结于肝组织是分泌该生长因子的主要场所。

胰腺癌肝转移的结果取决于胰腺肿瘤细胞与肝脏环境的相互作用，这些参与其中的分子识别和验证是证明肿瘤转移非随机理论的基础［37］。本研究利用小鼠胰腺癌肝转移模型，对相关转移分子进行初筛，结果与人体胰腺癌转移相关分子的基因表达水平变化趋势基本一致，可以作为转移机制及肿瘤药物研发的理想模型。但本研究仍然存在一定的局限性：建模数量较少；考虑到纳入研究的相关转移分子数量较多，未进行Western blot、免疫组织化学染色验证qRT-PCR 结果，未研究因子表达量之间的相关关系；对于部分转移相关因子的研究仅进行初筛，未对涉及的信号转导通路进行深入的研究，未来对这些方面可以继续探索。

综上所述，经脾小体积注射法成功构建胰腺癌动物模型，为筛选抗肿瘤药物和研究肿瘤转移行为提供了有效模型，应用前景较好；胰腺癌的侵袭转移是复杂的过程，涉及众多因素。深入揭示和理解胰腺癌侵袭转移的分子机制，将提供更多的胰腺癌预防和治疗的新靶点，有助于制定新的、有效的治疗策略，从而有望改善治疗效果，提高胰腺癌患者的生存率。