超声辐照联合静脉输注微泡对大鼠急性心肌梗死微循环的改善作用

高彦霞,贺文婷,秦署光,张 瑞,朱 丹,李丽君#,潘龙飞*

(1西安交通大学第二附属医院急诊科,西安 710004;2西安市第四医院急诊科;3西安交通大学第二附属医院心血管内科;*通讯作者,E-mail:panlonf@qq.com;#共同通讯作者,E-mail:lilijun3162003@aliyun.com)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是在冠状动脉病变的基础上,冠脉血供急剧减少或中断,从而使相应的心肌严重而持久地缺血缺氧所导致的心肌坏死。尽管近年来医疗水平不断提升,冠脉血管成形术、冠脉旁路搭桥及溶栓治疗的应用不断深入,住院病人的死亡率得以稳定下降,但急性心肌梗死后心衰的患者是增加的[1],考虑其与心梗血管再通治疗后仍存在微循环栓塞有关[2]。研究发现超声有辅助溶栓改善微循环的作用[3],但对于超声改善微循环的机制说法不一。本研究探讨超声联合微泡改善大鼠心肌梗死后梗死区微循环的方法及其机制,从而增加存活心肌数量,改善心梗预后。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性10周龄SD大鼠(SCXK(陕)2012-003)90只,清洁级,体质量(300±30)g,由西安交通大学医学院动物中心提供。于西安交通大学药物分析研究所清洁动物房饲养。饲养条件:6只大鼠/笼,室温23 ℃,相对湿度(50±10)%,饲予普通大鼠颗粒饲料,饮清水。

1.2 主要试剂与仪器

微泡为意大利Bracco公司产品,即注射用六氟化硫微泡(声诺维)为目前我国唯一批准临床使用的超声造影剂。声诺维为无菌冻干粉状,打开包装后,注入10 ml生理盐水并振摇,使生理盐水与瓶中粉末及气体混合均匀形成微泡混悬液,微泡的浓度为(2-5)×107个/ml,微泡平均直径为2.5 μm左右,能很好地通过肺循环。超声诊断仪(Sonosite180 Plus,美国,C60/5-2 MHz 60 mm凸阵探头,频率3.5 MHz,机械指数1.3),由西安交通大学第二附属医院超声科提供。

1.3 心肌梗死模型的制备

乙醚麻醉大鼠,仰卧位固定,胸部剃毛,75%酒精消毒,于胸骨左侧缘第4肋间纵行切开皮肤,止血钳钝性分离肌肉,用弯血管钳于胸骨左侧第4肋间稍用力打开胸腔,沿肋间隙方向迅速钝性分离肋间肌肉,血管钳垂直方向撑开肋间隙,暴露心脏,从胸腔内把心脏挤出,剪开心包膜,在肺动脉圆锥和左心耳之间下方约3 mm处,用4-0带针缝合线结扎冠状动脉左前降支,进针深度约1.5 mm,心肌梗死成功的标志为左心室前壁肌肉颜色变白,左室前壁心肌运动明显变弱。结扎后迅速将心脏送回胸腔并挤出胸腔内气体,用直止血钳夹闭胸壁切口。将大鼠侧卧位,若大鼠未恢复自主呼吸,则用左手拇指、食指及中指给大鼠做胸外按压约200次/min,至大鼠恢复自主呼吸为止。缝合切口,将大鼠侧卧于温暖的鼠笼内。整个开胸时间小于30 s。术后常规采食、饮水,腹腔注射青霉素钠80万U/d,连续3 d。

1.4 实验动物分组与处理

成功制备90只心肌梗死模型大鼠,随机分为超声微泡组、超声组、单纯心梗组,每组30只。超声微泡组大鼠于心梗后24 h和48 h,10%水合氯醛0.03 ml/kg腹腔注射麻醉,固定于手术台,用注射器抽取配好的微泡造影剂1 ml,经舌下静脉缓慢输注微泡10 min,同时诊断超声仪每隔5 s经胸壁辐照心肌共10 min。超声组大鼠1 ml生理盐水经舌下静脉滴注10 min,同时诊断超声仪每隔5 s经胸壁辐照心肌共10 min。单纯心梗组大鼠不做任何处理。所有大鼠分别于心梗模型前1 d、心梗模型制作成功后1,2,3 d记录大鼠心电图。超声微泡组和超声组大鼠于心梗后第1, 2天记录大鼠超声联合微泡治疗前和治疗后的心电图。

1.5 心脏标本的采集与固定

大鼠心肌梗死后第3天,每组取10只断颈处死,于心底部将心脏与大血管和组织剪断,取出心脏,用生理盐水将心脏冲洗干净,去除左右心房,用刀片沿着与左心室长轴垂直的切面将心脏中1/3切成3-4 mm厚的组织片,取标本的心肌梗死区,30 mg/L戊二醛4 ℃,固定2 h;PBS缓冲液漂洗3次,每次5 min;乙醇逐级脱水;真空干燥,将干燥后的标本沿左室长轴的垂直方向从中间掰开,将掰开的标本横断面向上黏贴在标本托盘上;真空喷金后扫描电镜观察心肌的微观结构。余大鼠(每组20只)于心梗后第28天断颈处死,于心底部将心脏与大血管和组织剪断,取出心脏,用生理盐水将心脏冲洗干净,去除左右心房。心肌标本用4%多聚甲醛固定24-48 h,石蜡包埋。将石蜡包埋的心肌组织制成5 μm厚度的切片,将载玻片用多聚赖氨酸处理后将切片黏附于该载玻片上,分别进行HE染色处理。光学显微镜下观察心肌组织的形态、坏死、炎性细胞浸润和梗死区瘢痕组织及血管新生等情况。

1.6 统计学分析

各组数据的计量资料用均数±标准差表示,统计分析采用SPSS17.0及Microsoft Excel软件进行分析,组间的两两比较采用t检验,心电图的组间比较采用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心电图结果

大鼠的心肌梗死模型制作前1 d、梗死后第1,2,3天分别记录Ⅱ导心电图。心肌梗死前大鼠的心电图正常;心肌梗死后第1天大鼠心电图ST段明显抬高;心肌梗死后第2天大鼠心电图ST段仍有抬高;心肌梗死后第3天大鼠心电图,可见坏死性Q波,ST段仍有抬高(见图1)。超声微泡组30只大鼠中有9只大鼠心电图于超声联合微泡治疗后出现室性心律失常(见图2),表现为QRS波宽大畸形(QRS间期平均值为40 ms,正常QRS波间期平均值为20 ms),T波倒置(平均深度为0.1 mV),次日恢复;超声组30只大鼠中有1只的心电图出现上述变化,单纯心梗组30只大鼠的心电图无上述变化。卡方检验数据显示:超声微泡组出现室性心律失常的大鼠数量与超声组相比,差异具有统计学意义(χ2=7.68,P=0.005 6);超声微泡组出现室性心律失常的大鼠数量与单纯心梗组相比,差异具有统计学意义(χ2=8.37,P=0.003 8);而超声组出现室性心律失常的大鼠数量与单纯心梗组相比,差异无统计学意义(χ2=0,P=1)。结果提示心律失常的发生与超声联合微泡改善微循环相关。

图1 单纯梗死组大鼠心电图Figure 1 Electrocardiogram in rats with simple infarction

2.2 扫描电镜观察心肌微结构结果

心梗后第3天,超声联合微泡组心梗大鼠心肌微结构好于其他组,可识别心肌纤维束状结构,但肌束间的间隙较正常心肌小且模糊(图3A)。单纯心梗组与超声组大鼠的心肌细胞纤维结构消失,原有的肌束结构紊乱并消失融合,呈现为杂乱无章、大小不一、松散状(图3B,C),但在心肌横断面仍可见血管断面及血管内的红细胞(图3B)。

图2 超声微泡组大鼠心电图Figure 2 Electrocardiogram of rats in ultrasound combined with microbubbles group

A.超声微泡组B.超声组C.单纯心梗组图3 扫描电镜图观察心肌微结构 (×500)Figure 3 Ultrastructure of myocardium under scanning electron microscope (×500)

2.3 HE染色计数心肌血管环数结果

大鼠心肌梗死后第28天HE染色结果及数据分析见图4,5。从图4可见超声微泡组血管环数量最多,存活的心肌也最多,提示增加血液的灌注可使心肌的存活量增加,单纯超声不能促血管环数增加,而超声联合微泡可增加血管环数量。梗死区可见较多血管环,在200倍显微镜下计数血管环数,超声微泡组最多,与超声组相比,差异具有统计学意义(t=10.53,P=0);与单纯心梗组相比,差异具有统计学意义(t=10.93,P=0)。单纯心梗组血管数最少,但与超声组相比,差异没有统计学意义(t=2.01,P=0.05)。

A.超声微泡组B.超声组C.单纯心梗组图4 梗死后28 d HE染色毛细血管环计数 (×200)Figure 4 HE staining of capillary ring count at 28 d after myocardial infarction (×200)

与超声组比较,*P<0.05;与单纯心梗组比较,#P<0.05图5 梗死后第28天毛细血管环计数Figure 5 Capillary ring count 28 d after infarction in three groups

3 讨论

研究表明,在急性心肌梗死后及时接受急诊溶栓或介入治疗的急性心肌梗死患者中,仍有65%患者的冠状动脉微循环存在持续性栓塞[2],部分患者因错过抢救时机冠脉闭塞难以溶解,使缺血心肌血供难以恢复,心肌大量坏死,随后被纤维组织取代,形成瘢痕组织,进而心室重构,成为心衰和死亡的主要原因。本研究显示,超声联合微泡可改善早期心肌梗死大鼠梗死区心肌的灌注,增加梗死区血管环数,改善梗死区心肌的微循环利于更多心肌细胞存活,从而减轻心肌纤维化、心室重构,使心功能得到改善。

冠脉内微血栓的形成是由斑块破裂引发凝血瀑布级联反应导致的[4]。Li等[3]研究发现超声联合微泡治疗可以溶解富含血小板和红细胞的微血栓,从而改善冠状动脉无复流的结果。在体外实验研究发现[5],超声辐照超声能量敏感型相变纳米微泡,可产生持续稳定的空化效应,有效清除人工血管的血栓,从而达到改善心肌梗死区微循环的作用。在体外微血管阻塞的模型中超声微泡的空化效应与组织纤溶酶激活剂联合应用可提高再灌注效果[6]。另外,在猪的心肌梗死模型中应用三维超声联合微泡可再通冠脉血管[7]。在急性心肌梗死早期溶栓或介入治疗过程中,再灌注性心律失常是冠脉血管再通的一个间接指征。本研究显示超声联合微泡组的大鼠心电图于超声联合微泡治疗后出现室性心律失常,次日恢复;超声组的大鼠只有1只心电图出现上述变化,无超声治疗的大鼠心电图无上述变化。提示心律失常的发生与超声联合微泡改善微循环相关。单纯诊断超声的能量对心肌没有影响,而只有在微泡存在的情况下,产生超声的物理效应可改善心肌的微循环。

研究表明,大鼠心肌梗死后骨髓间充质细胞在缺血的微环境下是不能向心肌细胞分化的且不能长期存活[8],因此改善心肌梗死后缺血心肌的微循环灌注至关重要。大量的研究表明,超声辐照微泡引发的生物学效应,可使微血管破裂,诱导炎症反应,使血管生长因子的表达水平增加,从而促进血管新生[9]。实验发现,促进梗死区域新生血管网形成,增加血流灌注[10],对改善心肌梗死的预后、提高心功能有非常重要的作用。Yoshida等[11]研究发现,超声介导微泡的破裂产生的微损伤和微出血,使炎症细胞浸润并释放VEGF,而VEGF促血管新生。在超声介导微泡破裂增强MSCs移植效应的研究中[12],也发现超声联合微泡使心肌内VEGF水平增加,新生的血管增加。本实验研究显示梗死区域血管数量越多,存活的心肌也越多,且超声联合微泡组血管环数量最多。这种血管再生可贡献于微循环的改善并有利于心肌再生,减缓心肌纤维化和瘢痕组织生成。

本研究所用的微泡声诺维(SonoVue)为第二代超声造影剂,其已广泛应用于临床超声造影检查,安全性已得到很好证实。实验中通过超声辐照声诺维微泡产生的空化效应等物理效应,可改善心梗模型大鼠梗死区心肌的微循环,改善预后。本研究的心梗模型的大鼠未行冠脉血管开通治疗,如在心梗后实行开通血管治疗的基础上再联合超声微泡治疗是否可以更好地改善心肌微循环,以及后续临床应用效果,均有待后续的实验结果验证。

总之,超声联合微泡可改善心肌梗死模型大鼠的梗死区微循环,增加血管环数及存活心肌,为急性心肌梗死的临床治疗和提高病患生存质量提供了一种值得尝试的方法。