κ-阿片受体激动剂对缺血/再灌注大鼠心肌及线粒体的保护作用

王渊博,田 竞,朱鎔湃

(北部战区总医院综合内科,沈阳 110000;*通讯作者,E-mail:709639557@qq.com)

2018年中国心血管病报告,大陆地区心血管病患者约2.9亿人,其中冠心病患者高达1 100万人,统计结果显示,冠心病的发病率呈上升态势发展。对冠心病进行对症治疗后,大部分患者暂时地脱离了生命危险,但并发症心肌I/R损伤的发病率不断增加。心肌I/R损伤会诱发心肌顿抑、心律失常和微循环障碍等症状[1],其发病机制可能与Ca2+超载、氧自由基增多、炎性因子释放及能量代谢等因素相关。线粒体是心肌细胞的产能细胞器,与心肌细胞的分化和凋亡等因素直接相关,还可以调控细胞的周期[2]。当心肌发生I/R损伤后,线粒体的结构和形态会发生改变,膜通透孔(mPTP)开放并释放细胞色素C,诱发I/R心肌细胞发生凋亡[3]。当心肌发生I/R时,通过增加线粒体乙醛脱氢酶(ALDH2)的表达可维持线粒体膜电位,进而减低心肌损伤[4],保护线粒体的功能及形态可能成为减轻心肌I/R损伤的一个新治疗靶点。κ-OR是心肌细胞最重要的表面受体之一,激活κ-OR对I/R损伤的心肌具有一定的保护作用[5],报道指出,这种保护作用可能与缺血预处理的机制相类似[6]。研究还发现,当心肌发生I/R时,激活κ-OR的同时,可以活化细胞内众多保护心肌细胞的分子或蛋白[7],其中包括影响mPTP开放的缝隙链接蛋白Cx43[8],但目前激活κ-OR保护损伤心肌的全部作用机制还没有完全被阐明,本实验目的是探讨激活κ-OR保护I/R损伤心肌的作用是否与影响线粒体的形态及功能变化相关。

1 材料和方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器

20只雄性SD大鼠(8周龄、SPF级、体质量220 g、许可证号SCXK辽2015-0001),由沈阳军区总医院动物实验中心提供,κ阿片受体激动剂U50488H和κ阿片受体阻断剂nor-BNI(美国Tocris公司),CK和LDH试剂盒(南京建成生物技术有限公司),细胞色素C抗体(美国Abcam公司),β-actin抗体(美国Cell Signaling Technology公司),VDAC1抗体(美国Cell Signaling Technology公司)山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(中国康为世纪公司),线粒体胞质提取试剂盒(上海碧云天公司)Western blotting配胶试剂盒(中国博士德公司),多功能酶标仪(美国Molecular Devises公司spectra MAX-190),透射电镜(日本电子公司JEM-1230)。

1.2 大鼠实验分组及模型的建立

20只8周龄雄性SD大鼠随机分成四组,每组5只,分别为对照组(sham)、缺血/再灌注组(I/R)、缺血/再灌注+κ阿片受体激动剂组(I/R+U50488H)、缺血/再灌注+κ阿片受体阻断剂+κ阿片受体激动剂组(I/R+N+U50488H)。用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠,连接呼吸机,分别在大鼠右颈外静脉和右颈内动脉建立取血和给药通道,开胸后明确冠状动脉位置后待处理。sham组用6-0缝合线在冠脉后方穿线,但不结扎,同时以1.25 ml/kg的剂量通过颈静脉给予生理盐水处理,手术进行至150 min时取材;I/R组用6-0缝合线结扎冠状动脉30 min,随后立即进行心肌再灌注120 min;I/R+U50488H组在再灌注同时给予U50488H(1.25 mg/kg);I/R+N+U50488H组在给予U50488H前15 min给予nor-BNI(2 mg/kg),各组分别在实验结束时通过颈内动脉取血液3-5 ml,而后取心脏结扎点以下2 mm处心肌组织待实验处理。

1.3 比色法检测血清CK和LDH活力

CK活力测定:各组大鼠模型制作完成时,立即从颈内动脉取血,并将各组大鼠血液在室温下静止1 h,静止结束后进行低速离心取上层血清,按照试剂盒说明书剂量分别加入1-5号试剂,摇匀后置于37 ℃水浴锅内静止20 min,再加入6号试剂及待测样本,摇匀后离心(3 500 r/min,20 min),取上层液并加入定磷剂,混匀后在45 ℃水浴锅内水浴15 min,双蒸水调零,用分光光度计检测吸光值(660 nm处1 cm光径比色),数值代入公式计算血清CK活力。

LDH活性测定:准备好血清后,按照试剂盒说明书先后加入双蒸水、2 mmol/L标准液、待测样本、基质缓冲液、辅酶Ⅰ应用液混匀后置于37 ℃水浴锅内静止15 min,而后加入2,4-二硝基苯肼0.25 ml并置于37 ℃水浴锅内静止15 min,加入0.4 mol/L NaOH溶液2.5 ml,混匀后室温静止3 min,双蒸水调零,用分光光度计检测吸光值(440 nm处1 cm光径比色),数值代入公式计算血清中LDH活性。

1.4 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡

取各组大鼠新鲜心肌组织用生理盐水漂洗后置于多聚甲醛中进行固定,将固定好的组织置于石蜡中,用保温箱进行热溶处理,待蜡完全侵入组织块后冷却蜡块并制作组织切片。对制作好的组织切片进行热熔及酒精脱蜡,脱蜡后用PBS漂洗,将蛋白酶K均匀喷涂于组织切片表面并静止30 min,静止结束后再次漂洗组织切片并将TUNEL1、2号混合液均匀喷涂于组织切片表面静止并60 min,上述步骤结束后对切片进行漂洗,随后立即喷涂DAPI染色液孵育3 min,上述操作均需避光进行操作,最后对组织切片漂洗后喷涂防荧光淬灭封片剂,加载盖玻片。用荧光显微镜拍照并统计分析。

1.5 透射电镜观察心肌细胞线粒体

各组大鼠模型制作完成后,即刻取等量心肌组织浸泡于戊二醛内过夜,次日用磷酸缓冲液分三次漂洗戊二醛固定好的组织,每次10 min,而后分别用50%，70%，80%，90%的丙酮分别脱水两次,每次10 min,再用100%丙酮脱水2次,每次15 min。脱水结束后用丙酮/包埋剂浸泡处理(在4 ℃冰箱内过夜),再用纯包埋剂浸泡处理(在4 ℃冰箱内静置过夜);最后进行包埋,分别用纯包埋剂在37 ℃和45 ℃条件下处理24 h。固化和切片,用透射电镜进行观察线粒体形态并统计分析。

1.6 Western blot法检测胞质及线粒体细胞色素C

取各组大鼠相同质量的心肌组织标本,参照线粒体/胞质蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白并进行蛋白定量。按配胶试剂盒说明书配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶,根据蛋白定量结果,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶各孔洞内按照实验分组顺序进行上样,上样结束后先用90 V的电压电泳30 min,再用120 V的电压电泳50 min,电泳结束后取出SDS-聚丙烯酰胺凝胶,用转膜架子将其与NC膜、厚滤纸固定好并置于转膜槽内进行转膜,电流调节为250 mA、时间为120 min。转膜结束后用PBST对NC膜漂洗3次后,将NC膜置于10%脱脂牛奶进行封闭1 h。封闭结束后再用PBST对固定好NC膜漂洗3次,每次5 min,将漂洗好的NC膜根据Marker标记的位置对目的蛋白和内参蛋白所在位置进行裁剪,分别置于1 ∶1 000的细胞色素C一抗稀释液内及1 ∶1 000的内参一抗稀释液内4 ℃过夜。次日取出NC膜后漂洗3次,再置于1 ∶5 000的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG抗体稀释液中浸润1 h,而后再次进行漂洗,漂洗结束后开始化学发光读取数据并进行数据分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠血清CK和LDH检测结果

为明确心肌I/R损伤程度,通过比色法检测各组大鼠血清CK和LDH的含量。与sham组相比较,I/R组血清CK和LDH明显增加(P<0.01);与I/R组相比较,I/R+U50488H组血清CK(P<0.05)和LDH(P<0.01)降低;与I/R+U50488H组相比较,I/R+N+U50488H组血清CK和LDH升高(P<0.05,见图1)。

与sham组比较,**P<0.01;与I/R组比较,#P<0.05，##P<0.01;与I/R+U50488H组比较,△P<0.05图1 四组大鼠血清CK和LDH的含量比较Figure 1 Comparison of serum CK and LDH levels among four groups

2.2 大鼠心肌细胞凋亡变化

为阐明激活κ-OR对各组大鼠心肌细胞凋亡的影响,利用TUNEL法检测凋亡细胞(绿色),并利用DAPI染核(蓝色),TUNEL与DAPI同时阳性表示细胞凋亡。与sham组相比较,I/R组心肌细胞凋亡率明显增加(P<0.01);与I/R组相比较,I/R+U50488H组心肌细胞凋亡率降低(P<0.05);与I/R+U50488H组相比较,I/R+N+U50488H组心肌细胞凋亡率升高(P<0.05,见图2,3)。

2.3 透射电镜观察大鼠心肌线粒体变化

为明确心肌线粒体病理学变化,通过透射电镜观察线粒体的空泡化率及线粒体平均面积。与sham组相比较,I/R组线粒体空泡率明显增加(P<0.01),且线粒体排列不整齐、分布杂乱,平均面积减小(P<0.01);与I/R组相比较,I/R+U50488H组线粒体空泡率降低(P<0.01),线粒体排列较整齐,平均面积相对增加(P<0.05);与I/R+U50488H组相比较,I/R+N+U50488H组线粒体空泡率增加(P<0.01),心肌线粒体损伤严重,平均面积减小(P<0.05,见图4)。

图2 不同处理后大鼠心肌细胞凋亡变化 (标尺=20 μm)Figure 2 Changes of rat cardiomyocyte apoptosis after different treatment (scale bar=20 μm)

与sham组比较,**P<0.01;与I/R组比较,#P<0.05;与I/R+U50488H组比较,△P<0.05图3 κ阿片受体激动剂对缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响Figure 3 Effect of κ-opioid receptor on myocardial apoptosis in I/R rats

2.4 大鼠心肌细胞质色素C的表达情况

为明确损伤心肌线粒体是否向细胞质内释放细胞色素C,通过Western blot实验分别检测线粒体内和胞质内细胞色素C含量。与sham组相比较,I/R组心肌细胞质内细胞色素C显著升高(P<0.01);与I/R组相比较,I/R+U50488H组心肌细胞浆内细胞色素C相对降低(P<0.01);与I/R+U50488H组相比较,I/R+N+U50488H组心肌细胞浆细胞色素C升高(P<0.05,见图5)。

3 讨论

冠心病(CHD)已经成为危害人类生命安全和健康的重要疾病之一,我国CHD发病率连年不断攀升,随着介入手术和溶栓治疗技术的不断完善和提高,急性冠心病的病死率得到有效遏制,但并发症心肌I/R损伤确成为了影响患者生存质量的重要因素之一。所以,积极有效地探讨心肌I/R损伤的发病机制及防治措施具有重要的研究意义。

κ-OR广泛存在于机体之中,是目前发现最丰富的细胞表面受体之一,激活κ-OR在镇痛、神经内分泌及免疫调节领域发挥着重要的作用[9],在其被发现以来,已经陆续被应用到多种药物作用的靶点。近年来研究发现,激活κ-OR对心肺系统具有一定的保护作用[10,11],研究认为这种保护作用来源于多种分子机制,包括缝隙链接蛋白(Cx43)、eNOS、自噬等,但激活κ-OR对心肌的保护作用是否与心肌线粒体相关目前并不完全明确。

与sham组比较,**P<0.01;与I/R组比较,##P<0.01,#P<0.05;与I/R+U50488H组比较,△P<0.05,△△P<0.01图4 大鼠心肌线粒体变化透射电镜结果 (标尺=1 μm)Figure 4 Changes of myocardial mitochondria in rats by transmission electron microscopy (scale bar=1 μm)

与sham组比较,**P<0.01;与I/R组比较,##P<0.01;与I/R+U50488H组比较,△P<0.05图5 κ阿片受体激动剂对大鼠心肌细胞色素C表达的影响Figure 5 Effect of κ-opioid receptor on expression of cytochrome C in rat myocardium

线粒体是心肌细胞的重要细胞器之一,主要起到为心肌细胞提供能量的作用,其形态的完整性是线粒体生存的基础,当线粒体受到外界损伤刺激时,线粒体形态及功能会发生相应的改变,包括线粒体内部会出现空泡、线粒体脊结构改变等,还可导致线粒体分裂[12],进而诱发线粒体功能紊乱、凋亡及自噬的增加。线粒体受到外界刺激发生损伤后,会发生膜电位降低、线粒体膜通透孔(mPTP)开放[4]等现象,随后线粒体会通过mPTP向胞质释放caspase家族蛋白及凋亡因子细胞色素C等[13],诱发心肌细胞凋亡。同时线粒体还会发生氧化磷酸化解耦连,ATP合成减弱,诱发心肌细胞坏死增加,可进一步地加重心肌I/R损伤,影响心肌功能[14]。

本实验针对I/R损伤后的心肌细胞及心肌线粒体进行了相关实验研究,结果显示,与sham组相比较,当心肌发生I/R损伤后,通过分析大鼠血清发现,心肌损伤标志物CK和LDH均发生了显著的增加(P<0.01);通过心肌TUNEL染色实验发现心肌细胞凋亡率也明显增加(P<0.01);利用透射电镜观察各组大鼠心肌线粒体形态发现,I/R损伤后的心肌线粒体发生了明显的形态学变化,大部分线粒体内部出现了空泡化现象(P<0.01),且线粒体内部结构紊乱,线粒体之间排列不整齐,散在分布于肌纤维之间,且平均面积减小(P<0.01),可以推测大部分线粒体发生了分裂;通过Western blot实验观察到,I/R损伤发生后,胞质内的细胞色素C含量明显增加,而线粒体内部分细胞色素C表达降低(P<0.01),结果表明心肌发生I/R损伤后,线粒体结构发生改变,同时线粒体会向细胞质内释放大量的细胞色素C,线粒体结构功能的紊乱可能是进一步增加心肌损伤的直接因素。在使用κ-OR激动剂U50488H激活细胞表面κ-OR后,与I/R组相比较,I/R+U组上述现象均得到了一定的改善,检测结果显示血清CK降低(P<0.05)、LDH亦降低(P<0.01)、心肌细胞凋亡率下降(P<0.05)。结果表明I/R+U组心肌损伤程度相对I/R组降低。利用透射电镜观察到I/R+U组线粒体空泡现象减少(P<0.01)，同时线粒体平均面积相对增加(P<0.05)；Western blot实验观察到线粒体内细胞色素C含量相对增加,细胞质内细胞色素C含量相对降低,结果表明激活κ-OR后,线粒体结构和功能相对得到了改善,减少了诱发心肌细胞损伤的相关因素。结果还显示,U50488H对心肌及线粒体的上述作用可以被κ-OR阻断剂nor-BNI所阻断。

综上所述,本研究表明当心肌发生I/R损伤后,通过U50488H激活κ-OR可以保护心肌线粒体,同时降低心肌的损伤程度,所以激活κ-OR对心肌的这种保护作用可能与保护线粒体相关,其相关作用机制有待进一步研究证实,该实验观点可能成为临床治疗心肌I/R损伤的新方法。