米炒灵芝的炮制工艺研究

陈欣茵 冯楚茵 林洁微 李汉辉 宋薇薇 夏 荃*

（1 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006；2 珠海李氏百草饮片有限公司，广东 珠海 519000）

灵芝 ［Ganoderma lucidum（Curtis：F）rKarst］.，是一常用中药，有保肝、抗肿瘤、抗炎、抗衰老、调节免疫力等功效［1］。作为药食兼用菌，灵芝质地坚硬，煎煮过程中其有效成分不易煎出［2-4］。故通过适当的炮制方法如炒法等，使灵芝的有效成分更多地溶出，对于提高灵芝的功效有重要意义。当代经大量药理研究表明，灵芝中的两大活性成分——灵芝多糖、灵芝三萜的含量与灵芝功效密切相关，二者是灵芝治疗多种疾病的物质基础［5-8］。本实验以灵芝多糖、灵芝三萜的含量变化为主要评价指标，优化灵芝的米炒法炮制工艺，为以后灵芝的日常使用，大规模制剂等提供数据支持，也为灵芝的进一步研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器 UV-5500PC紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；AUY220电子天平（日本岛津公司）；DHS20-1多功能红外水份仪（上海精密科学仪器有限公司）；TN40ALC红外测温仪（宝安康电子（北京）有限公司）。

1.2 试剂 葡萄糖（天津市大茂化学试剂厂，批号：20091020）；蒽酮（Aladdin Industrial Corporation，批号：1427042）；齐墩果酸（中国食品药品检定研究所，批号：110709-201607）；其他试剂均为分析纯。

1.3 药材 灵芝（珠海李氏百草饮片有限公司提供，批号：20160401，经广州中医药大学中药学院中药鉴定学教研室黄海波副教授鉴定为多孔菌科真菌紫芝Ganoderma sinense的干燥子实体）。

2 方法与结果

2.1 生灵芝 取原药材，去净杂质，切片。

2.2 米炒灵芝 先将炒制容器加热，加入一定量的米，用中火炒至冒烟时，投入净灵芝片，拌炒至所需程度，取出，筛去米，放凉。

2.3 水分测定 取样品粉末（过二号筛）约2 g，精密称定，置多功能红外水份仪中，于105℃下加热30 min，记录样品粉末的含水百分比，见表3。

2.4 浸出物测定 取各样品粉末各约2 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加水50 mL，依2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则2201项下的热浸法，以干燥品计算样品中水溶性浸出物的含量（%），见表3。

2.5 灵芝多糖含量测定

2.5.1 样品溶液制备 取样品粉末约2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水60 mL，静置1 h，加热回流4 h，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置烧瓶中，加水60 mL，加热回流3 h，趁热滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣用水5 mL溶解，边搅拌边缓慢滴加乙醇75 mL，摇匀，在4℃放置12 h，离心，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并转移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取溶液适量，离心，精密量取上清液3 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.5.2 对照品溶液制备 取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含0.12 mg的溶液，即得。

2.5.3 标准曲线制备 精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置10 mL具塞试管中，各加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密称取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，摇匀）6 mL，立即摇匀，放置15 min后，立即置冰浴中冷却15 min，取出，以水为空白，照紫外-可见分光光度法，在625 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得直线方程y=51.59x+0.037 8，相关系数r=0.9997，无水葡萄糖在3.0~18.0 μg/mL范围内，浓度与吸光度呈良好的线性关系，见图1。

图1 无水葡萄糖标准曲线

2.5.4 精密度试验 精密量取对照品溶液，置10 mL具塞试管中，加水至2.0 mL，照标准曲线制备项下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，测定吸光度，连续测定5次，无水葡萄糖的平均吸光度为0.806，RSD=0.1%（n=5），表明仪器精密度良好。

2.5.5 稳定性考察 精密量取样品溶液2 mL置10 mL具塞试管中，分别于 0，10，20，30，40，50，60，90，120，150，180，210 min照标准曲线制备项下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，测定吸光度，灵芝多糖的平均吸光度为0.357，RSD=1.4%（n=12），表明样品溶液在3.5 h内稳定性良好。

2.5.6 重现性试验 取同一样品粉末5份，按样品溶液制备项下的方法制备样品溶液，精密量取样品溶液2 mL，置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中无水葡萄糖含量，以药材干燥品计算样品中灵芝多糖平均含量为0.624%，RSD=1.2%（n=5），表明本方法重现性良好。

2.5.7 加样回收率试验 精密称取同一批已知含量的样品粉末（过二号筛）6份各约1 g，按样品溶液制备项下的方法制备样品溶液，并于“沉淀物用热水溶解并转移至50 mL量瓶中”此步中精密加入相当于样品中无水葡萄糖含量的无水葡萄糖对照品；精密量取样品溶液2 mL，置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，测定吸光度，计算灵芝多糖的含量和回收率，见表1。

表1 加样回收率试验结果 （n=6）

2.5.8 样品含量测定 精密量取1.2.5的样品溶液2 mL，置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中无水葡萄糖的含量，以药材干燥品计算样品中灵芝多糖的平均含量，见表3。

2.6 灵芝三萜含量测定

2.6.1 样品溶液制备 取样品粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇50 mL，超声处理（功率140 W，频率42 kHz）45 min，滤过，滤液置100 mL量瓶中，用适量乙醇，分次洗涤滤器和滤渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.6.2 对照品溶液制备 取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.6.3 标准曲线制备 精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别置15 mL具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密称取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得） 0.2 mL、高氯酸0.8 mL，摇匀，在70℃水浴中加热15 min，立即置冰浴中冷却5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，摇匀，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在546 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、含量为横坐标，绘制标准曲线，得直线方程y=10.437x-0.0575，相关系数r=0.9998，齐墩果酸在0.02~0.08 mg范围内，含量与吸光度呈良好线性关系，见图2。

图2 齐墩果酸标准曲线

2.6.4精密度试验 精密吸取样品溶液0.4 mL，按照标准曲线的制备项下的方法显色后，连续测定6次吸光度值，样品溶液的平均吸光度为0.288，RSD=0.2%（n=5），表明仪器精密度良好。

2.6.5 稳定性考察 精密吸取同一样品溶液0.4 mL，按照标准曲线的制备项下的方法显色后，分别于0，15，30，45，60，90，120，150，180，210 min 时测定吸光度，样品溶液的平均吸光度为0.279，RSD=1.9%（n=10），表明样品溶液显色后在3.5 h内稳定性良好。

2.6.6 重现性试验 准确称取同一样品粉末5份，按照样品溶液制备项下的方法制备样品溶液，分别精密吸取样品溶液0.4 mL，按照标准曲线的制备项下的方法显色，测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中灵芝三萜类化合物含量，以药材干燥品计算样品中灵芝三萜类化合物平均含量为0.473%，RSD=1.9%（n=5），表明本实验方法重现性良好。

2.6.7 加样回收率试验 精密称取同一批已知含量的样品6份各约1.0 g，加入一定量的齐墩果酸对照品，同法制得样品液，灵芝三萜的含量测定同“标准曲线制备”项下进行，测定吸光度，计算灵芝三萜及甾醇含量和回收率，见表2。

表2 加样回收率实验结果 （n=6）

2.6.8 样品含量测定 精密吸取1.2.6的样品溶液0.4 mL，按照标准曲线的制备项下的方法，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中灵芝三萜的含量，以药材干燥品计算样品中三萜类成分的含量，见表3。

2.7 实验结果 米炒灵芝的灵芝水分、水溶性浸出物、三萜类化合物含量测定，见表3。

表3 米炒至不同程度的成分含量测定结果

3 讨论

灵芝以生用为多，在实际应用中往往存在煎煮时间长，溶出率低等情况。笔者认为，通过适当的炮制方法，如炒法等，可以使其结构更疏松，或质地酥脆，从而增加其化学成分的溶出，进而增强药物疗效，但目前相关的研究较少。前期研究中，曾选用清炒、砂炒、米炒等3种炮制方法对灵芝进行炮制。实验过程中发现，灵芝片质地轻松，纤维结构多，清炒由于直接接触锅底，容易产生火星，导致药物焦化；而砂炒法锅温更高，药材在炒制过程中就更容易焦化，这2种炮制方法因实际操作难度大，故不予采用。选用米作固体辅料拌炒灵芝，一方面米作为传热的介质可使灵芝受热均匀，另一方面米在炒制过程中或可通过改变灵芝的质地性状增加灵芝多糖、灵芝三萜和浸出物的含量，同时米还可以作为判断指征，以其色泽变化观察火候。具有一定的优越性。

本实验采用米炒法对灵芝进行炮制，炮制前生灵芝的灵芝多糖和灵芝三萜只有0.627%和0.470%，炮制后，据实验数据显示，除了深黄组的水溶性浸出物含量略微下降外，不论将灵芝炒至何种程度，米炒炮制过的灵芝，其浸出物、多糖和三萜类成分含量均比生品高。结合三者在炮制前后的含量变化，其最佳炮制工艺为将米炒至焦黄色，米用量为20%。这可能是炒制后的灵芝质地酥脆，组织疏松，易于粉碎，而这一质地形状的改变使得灵芝子实体的致密结构被破坏，维持力减弱，使得在细胞壁内的灵芝多糖和三萜类成分较易溶出所致。将米炒至焦黄色时灵芝的多糖含量急速增加，含量最高，且比用其他米炒制的灵芝多糖含量高出接近1倍；但是炒制程度太过，可能会使部分灵芝三萜类化合物降解，因此，将米炒至焦黄色时灵芝的三萜类成分比深黄组的略有下降，这其中的反应机制还待进一步探讨。