卵巢癌患者血游离DNA的临床研究

刘俊宝，曹 璐，秦 瑞，沈美娜

(吉林大学中日联谊医院 妇产科，吉林 长春130033)

卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势，致病因素中遗传和环境因素逐渐受到重视。大多数外源性致癌物进入人体之后经过两个阶段代谢[1]，(1)经Ⅰ相代谢酶启动致癌过程；其典型代表是CYP450家族中的CYP1A1基因，而该基因中的MSPI多态性成为了主要的研究对象。(2)由Ⅱ相代谢酶发生解毒反应。比较有代表性的物质当属谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)中的GSTT1。因此，人体对肿瘤的易感性有可能与人体发生解毒代谢作用失衡和Ⅰ、Ⅱ相代谢酶将致癌物加以激活存在一定的关系。微卫星不稳定性(MSI)只在各种肿瘤组织中表达，使其成为肿瘤分子生物学中继抑癌基因和癌基因的研究后新出现的又一研究热点。本研究主要是从91例卵巢癌患者静脉血中提取DNA，然后进行CYP1A1MSPI多态性、GSTT1多态性及MSI的检测，为卵巢癌的早期诊断、评估以及预后提供一定的理论支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1标本 卵巢癌组：研究以回顾性分析法从2005年到2007年期间吉林大学中日联谊医院妇科所收治的，并经手术术后病理确诊为卵巢癌的患者中优选91例作为研究对象。对照组：在相同时期内所收治的15例没有出现遗传性病变的卵巢良性肿瘤患者。卵巢癌组中Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期的患者人数依次为23例(25.27%)、11例(12.09%)和57例(62.64%)。卵巢癌组临床病理类型：卵巢上皮性恶性肿瘤(共70例，占76.92%)，其中浆液性囊腺癌46例、黏液性囊腺癌12例、子宫内膜样癌10例、库肯勃瘤2例；卵巢非上皮性恶性肿瘤(共21例，占23.08%)其中生殖细胞恶性肿瘤10例，包括无性细胞瘤3例、恶性畸胎瘤2例、内胚窦瘤5例；性索间质恶性肿瘤6例(全部为颗粒细胞瘤)；卵巢转移癌5例。

1.1.2试剂 taq酶、 dNTP、 EB、聚丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等均购自北京鼎国生物技术有限责任公司。DL-2000 DNA MARKER购自大连TAKARA 公司。

1.2 方法

首先对三组患者进行血液标本的采集。采用回顾性分析法分析目标组患者的一般资料，然后采用常规酚-氯仿抽提基因组DNA，并进行特异性引物的设计，借助PCR-RFLP和PAGE-SSCP对该组患者血液标本中GSTT1基因多态性、CYP1A1基因MSPI多态性和MSI进行分析并判断其与卵巢癌易感性之间的关联。然后对其行测序验证处理，将实验结果与GenBank数据库资料进行对比分析，分析三者与卵巢癌患者临床病理分期和病理类型等之间的关联关系。

1.3 统计学分析

本研究所有实验数据经Excel初步处理后选用SPSS 18.0进行统计学分析。其中计数资料和临床资料依次选用比值比和描述性分析(包括构成比、中位数和率的分析)。另外对计数资料行卡方检验，旨在对比基因型在对照组和卵巢癌组中存在的差异。

2 结果

2.1 MSI在卵巢癌组织中的表达情况及与卵巢癌临床病理特征的关系

2.1.14个微卫星位点PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果 见图1-4，从图中我们可以发现其PCR扩增结果均为单一条带，且有着和引物设计的目的产物片段相同的长度。

图1 D5S346位点PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱

图2 D7S486位点产物的琼脂糖凝胶电泳图谱

图3 D11S904位点产物的琼脂糖凝胶电泳图谱

图4 D7S522 的琼脂糖凝胶电泳图谱

2.1.2PCR产物后的聚丙烯凝胶电泳 通过对比机体外周静脉血DNA的扩增后行PAGE的条带发现当癌组织DNA的微卫星位点等位基因出现减少或增多的时候，此时可以认定为MSI。除此之外，研究还针对全部的存在可疑病例和阳性病例给予二次PCR和电泳确定。本研究发现，在卵巢癌患者中，对其行PCR没有发现其出现了条带的迁移、缺失和增多等症状。通过对PCR产物进行PAGE分析发现样品有一部分发生条带增多，其中多出电泳带的样本就是发生MSI的样本，结果见图5-6。

图5 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱

图6 上述PCR产物的相对应的聚丙烯凝胶电泳图谱

2.1.3测序结果 对本研究中PAGE出现的多余条带和PCR产物琼脂糖凝胶电泳一条带实施测序分析。对疑有突变样本的基因和各微卫星位点的测序结果实施网络比对分析，结果发现其存在五处点突变，具体为：第5位和12位核苷酸发生C缺失；第164位和181位的C依次突变成为了A和G；而第185位上的核苷酸A则突变成了G。通过对全部疑似突变的样本实施测序比对分析。微卫星不稳定性与卵巢癌之间的关系见表1、表2。

表1 卵巢癌不同类型和MSI之间的关联

表2 卵巢肿瘤和MSI发生率之间的关联

2.2 CYP1A1基因MSPI多态性在卵巢癌中的表达情况及与卵巢癌临床病理特征的关系

2.2.1CYP1A1基因MSPI多态性的检测结果 CYP1A1基因的MSPI多态性具有A、B、C三种基因型，分别为野生型T/T；杂合型T/C； 突变纯合型C/C。给予所有卵巢癌患者实施CYP1A1基因MSPI多态性检测发现A、B和C基因型依次为50例(55%)、28例(31%)和13例(14%)。

2.2.2CYP1A1基因MSPI多态性与卵巢癌病理类型之间的关系 该基因A基因型组卵巢上皮性癌42例，卵巢非上皮性恶性肿瘤8例；B基因型组与C基因型组卵巢上皮性癌及卵巢非上皮性恶性肿瘤分别为17例及11例、11例及2例。对各个基因型组比对其卵巢非上皮性恶性肿瘤和上皮性恶性肿瘤发现，就病理类型构成比而言具备差异显著性。

2.3 GSTT1基因多态性在卵巢癌中的表达情况及与卵巢癌临床病理特征的关系

2.3.1PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果 结果显示GSTT1基因PCR扩增产物长度为450 bp，而GAPDH基因的PCR扩增产物长度则为746 bp。给予所有扩增产物实施琼脂糖凝胶电泳后根据其出现条带的数据可以判断为何种基因。例如当出现两条带时(450 bp和746 bp)可以判断其为GSTT1功能型(+/+)基因型，反之出现一条带时(746 bp)，则被认为是GSTT1缺失型(null)基因型。其PCR扩增结果如下图7所示。

图7 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图谱

在上图7中的电泳谱图中出现五条电泳道，其中第一条、二条、三条、四条和五条电泳道依次表示为DNA分子量的标记带、卵巢癌组样本、卵巢癌组样本、对照组样本和对照组样本。其中第一条谱带从下到上依次是100、250、500、1000和2 000 bp。第二条只有一条谱带(746bp)，第三条有两条谱带，从下到上依次是450和746 bp。通过谱带可以确认其为GSTT1功能型基因型。

就GSTT1缺失型基因型分布频率来说，对照组和卵巢癌组依次是14%(7/50)和35.1%(32/91)，经χ2检验两组相比较有显著性差异(χ2=6.205，P<0.05)。所以考虑GSTT1基因缺失可能增加患卵巢癌的风险。

2.3.2GSTT1基因多态性与卵巢癌临床分期的关系 患者早期(Ⅰ-Ⅱ期)和晚期(Ⅲ-Ⅳ期)GSTT1缺失型基因型频率分布分别为41%和32%，通过两组数据的卡方检验结果显示其并无统计学意义。具体数据如下表3所示。

表3 GSTT1基因缺失与卵巢癌分期的关系

2.3.3GSTT1基因多态性与卵巢癌病理类型的关系 GSTT1缺失型(null)基因型在卵巢上皮性恶性肿瘤和卵巢非上皮性恶性肿瘤中分布频率分别为43%(30/70)、14%(3/21)。GSTT1基因缺失在卵巢上皮性恶性肿瘤与对照组相比发现其具备统计学意义，但是对卵巢非上皮性恶性肿瘤而言与对照组相比其并不存在显著性差异。具体如下表4所示。

表4 GSTT1基因缺失与卵巢癌病理类型的关系

3 讨论

卵巢癌是女性生殖器三大恶性肿瘤之一，70%以上的患者发现时己属于晚期。而卵巢癌患者的外周血液中游离循环DNA会出现显著性提升，我们通过对血浆/血清DNA进行定性分析，针对其存在的肿瘤基因进行特异化检验，以期待探索一种新的可用于卵巢癌早期诊断和疗效监控的方法。

CYP1A1是细胞色素P450(Cyto-chrome P450,CYP)家族的一名成员,是活化二恶英等环境毒素的主要酶类[2]，它能够将一些毒素和致癌物质活化成为有很强亲电性的终产物或中间产物，之后通过和细胞内RNA、DNA以及蛋白质亲核基团等物质相互发生作用，进而导致细胞结构发生破坏，酶失活或出现功能障碍，继而导致体内某些基因表达异常或直接发生基因突变，促使细胞受到损伤，表现出发生肿瘤或程序性衰亡症状[3]。截止到目前为止，通过对CYP1A1基因的研究显示在其上面存在4个位点多态性(如CYP1A1基因MSPI多态性等)。本研究也发现，卵巢恶性肿瘤的患者中确实存在CYP1A1基因MSPI多态性，所以考虑CYP1A1基因多态性可以从恶性肿瘤患者的循环DNA中进行检测。本实验通过对卵巢癌组行GSTT1多态性检测显示，该基因的缺失促使患者患上卵巢癌的概率发生上升，因此可以认为GSTT1基因有可能是卵巢上皮性癌的易感基因。

微卫星不稳定的发生目前认为主要是错配修复基因的改变，正因为这一改变，才使得复制错误、错配碱基得不到正常的校正和修复，进而促使微卫星DNA发生变化，最终影响该DNA的正常调控，同时基因的稳定性也跟着发生变化，进而提升基因突变的概率，促发了恶性肿瘤的形成。本次研究结果表明，微卫星不稳定除了与患者的病理类型存在一定的关联以外还影响卵巢癌的分期。因此，我们认为，MSI很可能是肿瘤发生进展的一种体现。

采用特异性高的以PCR为基础的血液分析，检查两个基因标记物和微卫星不稳定，会提高试验的特异性和敏感性，有助于肿瘤的诊断。在其早期，通过动态性监测给予肿瘤患者治疗方案的确定提供一定的理论支撑，同时这种检查也会更容易被患者所接受。但是目前，受制于血液循环DNA量的改变，对肿瘤进行定性和定量诊断还有相当的难度。与此同时，因为肿瘤组织的异质性等原因，有部分检测结果会表现出假阳性或假阴性，这样就对肿瘤的早期诊断产生严重的干扰。当前针对在临床上应用循环血DNA检测还有待进一步的研究[4]。但依照其发展前景来看，其势必会成为临床研究的一大热点。