酒精性肝硬化患者维生素D受体多态性与病理分期、肝功能的关系

陈城曲,熊利芬,李蜀豫

酒精性肝病是因长期摄入大量酒精所致的肝脏病变，其终末阶段为酒精性肝硬化[1]。研究表明酒精性肝硬化死亡率非常高，且发病机制非常复杂，尚未彻底明确，可能与细胞凋亡、氧应激、细胞因子、免疫介导等因素相关，未来需进一步证实[2-3]。该病尚无特效药物进行治疗，尽早诊断病情对改善预后而言至关重要，有利于缓解病情，使代偿期延长[4-5]。近年来，有研究指出维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)多态性对肝脏疾病的评估具有一定作用，VDR是一种亲核蛋白，它能结合于维生素D活性代谢产物，并对其生物学效应进行介导[6-7]。本次研究纳入150例酒精性肝硬化患者为研究对象，分析这类患者维生素D受体多态性与病理进展、肝功能的关系，目的在于进一步了解酒精性肝硬化患者的病理进展特征，为临床治疗提供依据，改善预后，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

酒精性肝硬化：参考中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组[8]制定的《酒精性肝病诊疗指南(2010年修订版)》进行诊断：①临床症状为食欲减退、乏力、体重下降、鼻出血、牙龈出血、腹痛、营养差、肝掌等；②血常规检查提示白细胞计数下降、血小板水平下降；③病原学检查提示HDV-M/HCV-M/HBV-M呈阴性；④经彩超检查提示肝细胞破坏、肝包膜厚度增加、纤维组织增生、回声增强；⑤CT检查提示肝脏密度下降，伴有脾大、肝门变宽表现；⑥长期饮酒史，规律饮酒史≥15年，男性>40 g/d，女性>20 g/d。

1.2 一般资料

纳入我院2015年2月至2018年2月收治的酒精性肝硬化患者150例，采取回顾性分析，其中男102例，女48例，年龄42～76岁，平均(56.92±10.37)岁；病程2～8年，平均(5.42±1.69)年；Child-Pugh分级A级38例、B级58例、C级54例；血清谷丙转氨酶水平(47.53±12.75)U/L；血清总胆红素水平(15.34±7.42)μmol/L。研究方案经本院伦理委员会通过。

1.3 纳入与排除标准

1.3.1 纳入标准 ①符合上述提及的酒精性肝硬化诊断标准，临床诊断明确；②既往无自身免疫性肝病病史；③既往无药物性肝损伤、嗜肝病毒等病史；④病历资料完整；⑤入院前3个月内无抗肝硬化治疗史；⑥知情同意。

1.3.2 排除标准 ①因肝炎、药物、毒物等其他原因导致的肝硬化；②合并恶性肿瘤；③既往有精神病史、语言障碍史，无法配合研究；④除肝脏外，还合并心、肺、脑等重要脏器损害。

1.4 方法

1.4.1 检测方法 ①仪器：高速离心机、凝胶电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴箱、扩增仪、超净工作台。②试剂：PCR扩增试剂、无水乙醇、双蒸水、电泳级琼脂糖、淋巴细胞分离液、氯仿。③检测过程：所有患者均于入院当日采集2 ml空腹静脉血，置于抗凝管内抗凝，经离心处理后，将淋巴细胞分离，冻存备用，提取DNA。PCT引物序列：上游引物：5’-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3’；下游引物：5’-TGGCGGCAGCGGATGTACGTCTGC-3’。PCR反应条件：(94 ℃ 5 min、94℃ 30s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35个循环)，72 ℃ 5 min。经凝胶成像系统对VDR基因型进行判断。BB型：缺乏相应酶切位点，825 bp；bb型：存在相应酶切位点，650 bp、175 bp；Bb型：杂合子，650 bp、175 bp、825 bp。同时进行肝组织病理学检查，取肝组织后10%福尔马林固定5 h，酒精梯度脱水2 h，二甲苯透明4 h，包埋，切片机制备厚度4 μm切片，37 ℃烤干后，72 ℃烤片3 h，采取免疫组织化学法检测肝组织内VDR表达。

1.4.2 分组方法 采取病理组织学检查进行病理组织学分期。Ⅰ期：汇管区胶原增多或扩大，轻度窦周纤维化，轻度静脉周纤维化；Ⅱ期：重度窦周纤维化，小叶内纤维分隔，中度静脉周纤维化；Ⅲ期：多数纤维间隔出现，小叶结构紊乱；Ⅳ期：早期小结节性肝硬化[9]。

1.5 观察指标

比较两组患者的VDR基因型频率，并收集两组临床特征，包括性别、年龄、病程、Child-Pugh分级、基因型以及血清白蛋白、总胆红素、谷草转氨酶、白蛋白/谷草转氨酶水平。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 VDR在酒精性肝硬化中表达图片

VDR在酒精性肝硬化中表达见图1，主要在细胞质中表达，呈棕黄色(箭头处)，而在细胞核中基本无表达。

图1 VDR在酒精性肝硬化中表达(免疫组化法图，200×)

2.2 两组临床特征比较

Ⅰ～Ⅱ期组的Child-PughA级、BB基因型频率、谷丙转氨酶<40U/L占比高于Ⅲ～Ⅳ期组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组临床特征比较 [n(%)]

表2 量化赋值表

2.3 酒精性肝硬化患者病理进展的危险因素分析

采用Logistic回归模型对各量表进行量化赋值，见表3，将性别、年龄、病程、Child-Pugh分级、基因型频率、谷丙转氨酶、总胆红素、谷丙转氨酶/谷草转氨酶作为自变量纳入多因素分析，结果提示Child-PughC级、bb基因型频率、谷丙转氨酶≥40 U/L是酒精肝硬化病理进展的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

2.4 不同VDR基因型频率患者的肝功能指标比较

bb型基因的血清谷丙转氨酶水平高于Bb、BB型基因，差异有统计学意义(P<0.05)，三组血清总胆红素、谷丙转氨酶/谷草转氨酶比较无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表3 酒精性肝硬化病理进展危险因素Logistic回归分析

表4 不同VDR基因型频率患者的肝功能指标比较

注：与bb组比较，*P<0.05

3 讨论

酒精性肝硬化具有发病率高、死亡率高等特点，其发病与长期酗酒密切相关[10]。该病以50岁左右男性居多，早期无明显症状，伴或不伴食欲不振、牙龈出血、乏力、体重下降等表现，随着病情进展，患者会出现明显症状[11-12]。研究表明长期酗酒会减少肠粘膜叶酸吸收，与此同时，肝脏摄取量也明显下降，致使机体叶酸含量降低[13-14]。此外，长期酗酒会导致肝脏MS活性受到抑制，影响肝脏微循环，加重肝脏损害[15]。近年来，有研究认为VDR基因多态性参与了多类疾病的进展过程，如肾病、乳腺癌、前列腺癌、乙型肝炎等，并对患者预后影响非常大[16-17]。VDR在很多组织细胞内均存在，它与肾脏、肠粘膜等钙磷代谢密切相关，能调控靶基因转录，充分发挥生物学作用[18]。

本次研究针对酒精性肝硬化患者进行研究，结果提示Ⅰ～Ⅱ期患者的组bb基因型频率低于Ⅲ～Ⅳ期患者，而BB基因型频率高于Ⅲ～Ⅳ期患者，表明患者病情严重度与VDR基因多态性可能存在关联。VDR基因可能对VDRmRNA稳定性、表达水平有调节作用，从而影响VDR活性、数量的变化，使其与DNA结合能力发生改变，促进疾病进展[19-20]。1，25-(OH)2D3是机体维生素D活性形式，既往研究发现它对血磷、血钙水平有调节作用，此外，它还具有调节免疫、抗细胞增殖等功能[21]。另有研究发现它能将巨噬细胞、单核细胞激活，对淋巴细胞增殖存在抑制作用，可促使白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素12(IL-12)、γ干扰素(INF-γ)分泌减少[22]。笔者结合既往研究[23]与本次实践，认为VDR基因多态性可能通过削弱1，25-(OH)2D3的炎症、免疫调节作用，促进酒精性肝硬化患者病情进展，从而加重疾病严重度。

笔者采用Logistic回归模型，证实Child-PughC级、bb基因型频率、谷丙转氨酶≥40U/L是酒精肝硬化病理进展的危险因素。已有研究证实Child-Pugh分级、谷丙转氨酶增高与酒精性肝硬化疾病严重度相关[24]，与本研究结论基本吻合。本次研究的创新之处在于证实bb基因型频率也与酒精性肝硬化病理进展密切相关。此外，通过分析患者的肝功能指标，发现bb型基因的血清谷丙转氨酶水平高于Bb、BB型基因，提示bb型基因的患者肝功能损害最重。这可能的机制在于bb基因型利用其对VDRmRNA转录的影响，从而对其功能、表达进行抑制，加重体内免疫反应，而机体部分抗原免耐受功能削弱，导致病情进展[25]。此外，有研究发现VDR基因多态性可促进1，25-(OH)2D3与VDR相结合，从而对机体免疫进行调节，进一步作用于免疫反应，影响其反应类型、反应强度，并调节炎症因子分泌[26]。另有研究提示bb型基因可导致多种炎症因子水平上调，如白介素-6(IL-6)、白介素-1(IL-1)等，这可能是bb型基因促进病理进展的机制之一[27]。

综上，本研究证实随着酒精性肝硬化患者病理进展，其bb基因型频率增高，BB基因型频率下降，且bb基因型频率增高是患者病理进展的危险因素，该基因型会加重患者肝损害程度，临床需对此引起重视，便于为疾病治疗提供依据，改善预后。本次研究的局限性在于因受纳入病例时间、研究经费的影响，导致样本量偏少，未来需扩大样本量进行更深入研究。