Pooling PCR技术用于发现病程早期HIV感染者的研究

唐翼龙 ，易志强 ，刘丽萍 ，靳廷丽 ，张娜 ，丁晨 ，廖清华

(1．江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029；2．深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518055)

在艾滋病防治中，找到HIV感染者并加以有效管理是控制艾滋病流行的科学方法之一。在病程早期（急性感染期），感染者体内的艾滋病病毒复制活跃，其通过性行为等途径感染配偶/性伴的效率最高，如能在这个阶段就将这些HIV感染者诊断出来，有利于感染者本人通过自身行为改变或疾病防控部门采取适当措施切断传播途径，可以减少”二代病例”的产生，非常有利于艾滋病疫情的控制。第3版《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》据此推荐急性感染期HIV携带者应当接受治疗[1]。实际工作中，常使用WB法抗体检测技术诊断高危行为者是否感染HIV病毒。但是，人体从接触病毒到产生较高滴度的抗体，一般要4周左右的时间，所以HIV抗体检测技术难以发现病程早期的HIV感染者。而Pooling PCR是一种核酸检测技术，它利用核酸的体外高效指数扩增原理，在急性感染期即可检测出艾滋病高危行为者的血样中是否存在HIV病毒RNA，在病程早期就可以对就诊者/求询者的艾滋病病毒的感染状况做出诊断[2]；同时，这种技术也适合用于处理大批量的临床样本。国内已有单位将Pooling PCR技术应用于献血员的血液筛查[3]，但未见有在男男同性恋（MSM）、性病门诊就诊者、其他就诊者等等人群中应用的报道。本项目联合江西省内4家医疗卫生机构，在男男同性恋者、性病门诊就诊者、其他就诊者等人群中开展Pooling PCR检测技术的应用性研究，探讨该技术在医疗机构各就诊人群中应用的可行性，现报告如下。

1 材料与方法

1．1 对象 2016年7月-12月，在南昌市辖区内收集4家医疗机构留存的男男同性恋人群 （疾控中心VCT门诊）、性病门诊就诊者（专科医院，部分样本）、其他就诊者（省级综合性医院，部分样本）、体检人群（省级综合性医院，部分样本）的HIV抗体阴性血样；从艾滋病防治信息系统中导出相应单位同时期的检测数据。

1．2 仪器与试剂 仪器为罗氏cobas AmpliPrep/TaqMan全自动核酸检测系统；试剂为配套的COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test，v2．0。

1．3 方法 集合核酸法[4]

1．3．1 样品集合程序 在登记表格上记录一级和二级集合及对应的原始样品编号；吸取130μl样品，移入标记二级集合的离心管中；10例样品形成一个1300μl的二级集合样品，充分涡旋震荡混匀；从5个二级集合管中分别吸取210μl样品，移入标记有一级集合的离心管中，形成由50例样品1050μl体积组成的一级集合样品，充分涡旋震荡混匀；从每个一、二级集合管中吸取1000μl集合样品，分装至另一相应标记的S-tube管，用罗氏病毒载量检测试剂进行检测；制备阴性集合外部质控品：使用50例HIV抗体和核酸阴性样品，按上述步骤，分别集合成5个阴性二级集合外部质控品和1个一级集合外部质控品；制备阳性集合外部质控品：从9例HIV抗体和核酸阴性样品和一份至少含有HIV RNA103c/ml阳性样品中，分别移取130μl加入离心管中，形成一个1300μl的阳性二级集合外部质控品。再分别从4个已制备好的阴性二级集合外部质控品和上述阳性二级集合外部质控品中，移取210μl至标记为一级阳性集合外部质控品的离心管中，形成一级阳性集合外部质控品；一级和二级阴、阳性集合外部质控品分别用于RT-PCR中每一轮一级和二级集合样品的检测。

1．3．2 样品的分解检测程序 用罗氏CTM96病毒载量仪及配套的试剂盒对一级集合样品进行检测，阳性反应的一级集合样品进入下一检测步骤；用上述检测方法对所有组成阳性一级集合的二级集合样品进行检测，阳性反应的二级集合样品进入下一检测步骤；用上述检测方法检测所有组成阳性二级集合样品的的10例单个样品，确定核酸阳性的单个样品。

2 结果

2．1 不同人群HIV核酸阳性率情况 本研究共收集样本2644例，其中，男男同性恋人群全部样本做了核酸检测；其它3类人群因研究经费所限，只抽取了部分抗体阴性的样本做核酸检测。但HIV抗体阳性的样本通过给病人做HIV病毒载量的途径全部做了核酸检测。男男同性恋人群HIV核酸阳性率为554．27/万，根据徐红等人报道，感染率更高[5]；性病门诊就诊者人群次之，为不低于119．13/万，数据高于古彩虹[6]等人报道，低于郑伯敏[7]报道，与李桂英[8]等人报道接近；体检人群没有发现HIV核酸阳性；医疗机构1的其他就诊者人群核酸阳性率（≥85．54/万）要高于医疗机构2的其他就诊者人群（≥21．04/万）。4个医疗卫生机构所留存的4类人群的抗体检测阴性样本中有2类人群检出HIV病毒核酸阳性，共检出病程早期感染（HIV抗体阴性，但核酸阳性）样本3例，其中男男同性恋人群检出2例、性病门诊就诊者人群检出1例。见表1。

2．2 Pooling PCR检测技术成本分析 一般国产第三代酶联HIV抗体检测试剂均价5元/人份左右；发光法检测试剂则成本稍高，为25元/人份左右。对于Pooling PCR方法，1份检测试剂价格在500元左右。但是，如果混合50例样本做一个Pool，则相当于10元/人份样本，如混合100例样本做一个Pool，则检测试剂成本低至5元/人份样本。集合的大小可以根据工作经费情况来定。工作经费充足，则可以做小集合（50例样本），用于发现更低HIVRNA拷贝数的患者；工作经费相对不足，则可以做较大的集合（100份样本）。

表1 4个医疗机构中4类就诊人群HIV核酸阳性率情况

3 讨论

在艾滋病防制中，找到病毒感染者并加以有效管理是控制艾滋病流行的有效方法。最理想的情况是，在病程早期即急性感染阶段即将HIV病人诊断出来，从而避免配偶/性伴之间的传播[9]。因方法本身的局限性，用抗体检测技术筛查高危人群时，会导致“漏掉”病程早期（急性感染期）的那一部分感染者；因为，人体免疫系统接触到病毒后一般要4周左右的时间才能产生较高滴度的抗体，所以，使用HIV抗体检测方法难以发现早期艾滋病病毒感染者。而Pooling PCR方法正好可以解决这个问题。它是一种核酸检测技术，它可以检测出有高危行为者的血样中的HIV病毒RNA，在疾病早期就可以对就诊病人的艾滋病病毒的感染状况做出诊断。本研究提示男男同性恋（MSM）[10]、性病门诊就诊者（STD)人群检HIV核酸阳性率分别排第一、第二位。其中男男同性恋人群HIV核酸阳性率为 554．27/万，与李东民等人报道接近[11]；性病门诊就诊者人群次之，为不低于 119．13/万[12，13]。 这2类人群均检出急性感染期的HIV病毒携带者。另外，即使同为“其他就诊者”人群，两个医疗机构的这个人群的核酸阳性率也有差异，原因在于，“医疗机构1”为结核病收治医院，艾滋病病毒感染者更有可能因发热、皮肤疾病、咳嗽 （结核病引起）、腹泻等非特异性传染病症状而去传染病医院求诊，进而被诊断出来[14]。理论上来说，在传染病医院或感染科/发热门诊也更有可能发现早期HIV携带者[15]。众所周知，在HIV感染的早期阶段即开始抗病毒治疗，有利于感染者的免疫重建，从而有利于病人的救治；更为重要的是，因为病程早期（急性感染期）艾滋病病毒感染者体内病毒复制活跃，其通过性行为等途径感染配偶/性伴的效率最高，如能在此时将这些感染者诊断出来，非常有利于感染者本人通过行为改变及卫生防疫部门采取适当措施切断传播途径，以减少二代病例的产生，非常有利于艾滋病疫情的防控。

综上可见，Pooling PCR技术较抗体检测方法更为敏感。本人早前的研究表明，自愿咨询检测者及其他就诊者是江西省HIV感染者病例报告数多且感染率高的人群[16]，预期使用Pooling PCR技术能在这两类人群中发现早期HIV感染者，后续可以做扩大样本的研究。建议将该方法推广应用于男男同性恋、性病门诊就诊者、自愿咨询检测者及其他就诊者（感染科病人），作为这几类人群的常规检测手段，用于诊断病程早期（HIV抗体阴性但核酸阳性）的艾滋病病毒感染者。另外，应用Pooling PCR检测技术检测的是混合样本，人均检测成本并不高。所以，这方法用于就诊的其他人群也是可行的。在实验室人员技术能力、设备条件都具备的情况下，可以考虑用Pooling PCR检测技术取代HIV抗体检测方法。