建立梯度模型探讨溶血对TMA核酸检测的影响

田耘博，魏兰，李维，欧阳熊妍

(重庆市血液中心，重庆 400015)

血液病毒核酸检测（nucleic acid testing，NAT）直接检测病毒核酸，与酶联免疫吸附法(ELISA)相比能缩短血液病毒检测的窗口期，更好地保障血液安全，已成为许多国家血液筛查病毒的必要手段[1，2]，目前我国也已全面开展血液病毒核酸检测[3]。标本采集、处理、保存等因素对保证NAT检测结果的准确性尤为重要[4]。若标本采集、处理不当可能导致溶血，血浆中Hb可能会影响血液病毒核酸检测的有效性和准确性[5-7]。如果实验室一概拒收溶血标本，重新采集标本可能会非常困难，甚至会影响血液的有效及时供给，产生或增大血液供给矛盾。从母袋内重新留样进行ELISA和NAT检测，有可能因抗凝剂的稀释造成弱阳性标本漏检[8]；除了稀释的影响外，母袋重新留样还可能面临核酸降解及污染的问题。因此，探讨标本溶血对NAT检测结果的影响意义重大，可为实验室提供可接受的溶血范围，保护珍贵的血液资源。

目前应用于血液病毒筛查的NAT技术主要有多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术和转录介导的扩增（transcription mediated amplifi-cation，TMA）技术[2]。PCR是最早应用的核酸扩增技术，但随着NAT在全世界的成功推广，TMA在NAT中的应用范围已不亚于PCR[9]。调研文献发现，目前国内外尚无标本溶血对基于TMA技术的NAT检测结果影响较为详细的研究。因此，本研究旨在通过建立梯度溶血程度和梯度病毒载量的标本模型，分析含不同病毒载量的系列溶血程度标本的NAT结果，探讨溶血对血液病毒核酸检测的影响，以明确溶血程度与NAT灵敏度之间的关系，为实验室提供可接受的溶血范围，保护血液资源，以促进临床输血检验技术发展。

1 材料与方法

1．1 标本来源及筛选 收集重庆市血液中心2017年5月-2017年7月经体检和血液初筛检验合格的无偿献血标本500份，分别用含分离胶的“非可替”抗凝真空管（含EDTA-K2喷雾干粉）采集6～8ml全血用于NAT检测；“BD”抗凝真空采血管（含EDTA-K2喷雾干粉）采集4～5ml全血用于ELISA检测。采集后的标本管置于4℃保存，在采集4～6h内2000g离心15min，检测前置于4℃保存，分别进行ELISA和NAT。挑选ELISA和NAT均为非反应性的标本，封口胶密封后4℃保存，1周内使用。本研究方案获得重庆市血液中心伦理委员会的批准。

1．2 主要仪器 TEKEN RSP150/200型全自动加样仪（瑞士TEKEN公司）和FAME 2420/30全自动酶免 分 析 仪 （瑞 士 HAMILTON公 司 ）、Procleix TIGRIS全自动核酸检测分析系统 （西班牙盖立复公司）及配套的PRI(试剂准备温育器，美国Chiron公司)、M-series AD血细胞分析仪（瑞典MEDONIC公司）、RT3100洗板机 （深圳雷杜公司）、EXL808酶标仪（美国BIO-TEK公司）、L535R离心机（湖南湘仪公司）、KQ218超声波清洗器 （江苏昆山市超声波仪器有限公司）。

1．3 主要试剂

1．3．1 ELISA检测试剂 乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂：北京万泰、英国索林；丙型肝炎病毒抗体诊断试剂：北京万泰、美国强生；HIV（1+2）P24 抗原及抗体诊断试剂：法国伯乐，HIV抗体诊断试剂：上海科华。

1．3．2 核酸检测试剂 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1型）NAT试剂盒（TMA-化学发光法）”（Procleix Ultrio Plus Assay）， 美国Hologic公司。该试剂可同时定性检测人类血浆中的HIV-1 RNA、HCV RNA和 HBV DNA，试剂盒内含有配套的Procleix Plus HIV-1/HBV/HCV鉴别试剂。

1．3．3 病毒标准品 HIV、HCV、HBV 的血浆病毒质控品（北京万泰公司），均为有证标准物质，浓度分别为：HIV 200IU/ml、HCV 30IU/ml、HBV 30IU/ml。

1．4 梯度溶血程度和梯度病毒载量的实用性研究标本模型建立

1．4．1 梯度溶血程度和梯度病毒载量 根据所用检测试剂说明书[10]和参考类似研究[11-13]，我们将本研究的溶血程度分为5个梯度，血浆Hb浓度从低到高依次为 0g/L（肉眼观察无溶血）、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L。因病毒载量过低时易出现检测阴性，将难以判定是溶血导致假阴性还是低病毒载量下检出率较低的影响，所以本研究根据试剂说明书的检测下限和有关核酸检测质控品浓度设置的研究报道[14]，将病毒浓载量分为2个水平，低水平组：HIV 20IU/ml、HCV 10IU/ml、HBV 5IU/ml； 高 水 平 组 ：HIV 60IU/ml、HCV 20IU/ml、HBV 15IU/ml。

1．4．2 创建梯度溶血程度和梯度病毒载量的标本模型 将商品化的HIV、HCV、HBV核酸检测血浆病毒质控品作为病毒标准品，进行稀释建立梯度病毒载量的标本。为避免基质效应[15]，采用NAT和ELISA检测均合格的无溶血血浆作为稀释液，按实验设计的病毒载量水平对标准品进行稀释。

1．4．3 溶血模型的制备 取NAT和 ELISA检测均合格的核酸标本管中压积红细胞，与等量去离子水混匀后使用超声波破碎红细胞，具体的超声波破碎红细胞装置如图1所示，采用去离子水煮沸冷却后制得的脱气水作为声传导介质[16]。具体操作流程如下：超声波作用5min→颠倒混匀10次→超声波再次作用5min→颠倒混匀10次→2000g离心15min→转移上半部分液体到洁净试管，作为溶血标本原液，血细胞分析仪检测其Hb浓度。用血细胞分析仪测量离心后的溶血血浆Hb浓度[17]，与已知病毒载量的标准品混合，通过经检验合格的无溶血血浆调节含病毒的溶血标本体积，配制成按实验设计的Hb浓度和病毒载量。溶血程度Hb为40g/L时的具体配比见表1，其余Hb梯度浓度的配比按照设定的浓度计算，进行配制。

1．4．4 测试标本的准备 根据试剂说明书， 每次NAT检测需500μl样本，为确保样本量的充足，本研究每支测试标本量为1ml。测试标本管按病毒含量分为对照组（不含病毒）、低水平组、高水平组，按溶血程度（Hb 浓度）分为 0g/L、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L 5个组。

表1 Hb浓度为40g/L时病毒高低水平组测试标本的配制

图1 超声波致红细胞溶血装置示意图

1．4．5 溶血模型的验证 按上述方法配制的溶血模型，在每次进行核酸检测前，均同时取一支对照管在血细胞分析仪上进行检测，验证血红蛋白含量是否达到预期值。

1．5 检测过程 本研究实验在重庆市血液中心现有的NAT全自动系统PROCLEIX TIGRIS上进行，采用的配套的试剂。根据试剂盒说明书[10]，HIV、HCV、HBV病毒联检和鉴别检测之间的特异性和灵敏度没有显著性差异。因此我们采用HIV、HCV、HBV病毒联检的方式进行检测实验。本研究进行了3批次总计240个标本的检测。每批次检测的标本包括HIV、HCV、HBV每种病毒的高低2个病毒载量水平，每个水平分别包括Hb 5g/L、10g/L、20g/L、40g/L 4个梯度浓度，每个梯度浓度的标本平行配制3管；Hb为0g/L，即不溶血时，高病毒载量水平组能确定检出[10，14]，因此只配制了低病毒载量水平组，每种病毒1个，用作研究测试的质控管；在每批次测试时，对每个Hb的梯度浓度级别，均配制1个不含病毒的对照管，因此每批的测试标本数为80个。具体核酸检测操作参见相关核酸检测研究文章[18]。

1．6 数据统计和分析 将各测试标本的数据输入电脑，采用Microsoft Excel软件进行记录，用SAS8．1统计软件进行分析。溶血模型的Hb浓度验证进行总体均数的区间估计，采用t检验的方式进行均值显著性检验，显著性水平α=0．05，P＜α为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 溶血标本的验证结果 本研究所建立的Hb梯度浓度溶血模型中的Hb浓度，均在95%的置信区间范围内，P值均大于α，因此，每个Hb梯度内各标本管的Hb浓度比较差异无统计学意义。见表2。

表2 溶血标本验证测试结果

2．2 核酸检测结果 本研究3个测试批次，每批次80个，共计240个测试标本。Hb分别为0g/L、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L 的梯度浓度， 病毒载量分别是 高 水 平 组 ：HIV 60IU/ml、HCV 20IU/ml、HBV 15IU/ml， 低 水 平 组 ：HIV 20IU/ml、HCV 10IU/ml、HBV 5IU/ml，共225个测试标本，均呈反应性。对照管（未加病毒的测试标本）均呈非反应性。见表3。

3 讨论

目前在研究溶血对核酸检测影响的报道中[11-13，19]，采用的溶血方式多为反复冻融、机械破坏等，这些方法耗时较长，虽能将红细胞膜破坏，但也容易导致Hb的变性。在本研究中，利用超声波的机械效应、空化效应破碎红细胞致红细胞溶血，建立溶血模型，操作时间较短，可提高研究实验的效率。超声波致红细胞溶解的最佳条件需要的声强不高[16]，因此利用超声波清洗仪的超声波能量，即可对红细胞进行破坏释放出其内的血红蛋白，制得溶血标本。为保证超声波的传导效果，减少超声波由于空化机制在超声波清洗仪容器内液体中传导的能量耗损，我们将去离子水通过煮沸后冷却的方式制成脱气水，作为声波传导介质[16]，比单用普通去离子水更利于声能传导，进一步提高了细胞破碎效率。而在制备溶血标本原液时，由于超声波在全血中的声能衰减比水中大，为了减少不必要的声衰减，提高超声破碎细胞的效能，同时为了避免完全用压积红细胞破碎后形成的溶血标本粘度大而难以定量吸取的问题，采用等量去离子水稀释混匀红细胞后再用超声波破碎。充分破碎红细胞后离心，红细胞碎片沉降到底部，但离心后标本溶血程度较重，难以肉眼分辨细胞碎片和上层液体的分界线，为尽量避免在吸取溶血标本原液时吸入红细胞碎片，只吸取离心后的上半部分液体。

表3 测试标本管分组检测结果

目前，有较多的关于溶血对核酸检测影响的研究报道，但基本上都集中在基于PCR技术的NAT 方面[11-13，19，20]。这些研究中设置的 Hb 浓度范围各不相同，多数在20g/L之内，但有的甚至高达240g/L，正常人的Hb通常在160g/L，即便全部溶血，也很难达到那么高。因此，本研究在广泛查阅类似研究文献的基础上，结合所用TMA核酸检测技术和工作的实际情况，将最高溶血浓度设定在40g/L。从5g/L开始研究，也是基于说明书中明确指出该溶血程度不会影响检测效果[10]。通过本研究建立Hb浓度梯度模型，每次检测前同时进行的Hb浓度检测，对结果进行统计学分析，P值均小于α，因此每个Hb梯度浓度的各标本Hb浓度差异无统计学意义，表明实际的溶血程度达到了预期要求。

通过本研究发现，当溶血程度达到Hb 40g/L时，仍然对检测结果没有影响。这个范围远高于试剂说明书中Hb≤5g/L时对检测没有影响的限度。说明基于TMA的NAT对标本溶血具有较强的抗干扰能力。而对基于PCR的NAT，当标本出现溶血时红细胞破碎释放出游离Hb及其衍生物质，这些物质会严重降低PCR扩增效率，直接影响NAT检测结果的准确性[21，22]。溶血对PCR的影响原因，主要是Hb中的血红素或其代谢产物是DNA聚合酶的抑制剂[23]。有研究发现标本轻度溶血时对HBVDNA定量结果无明显影响，但重度溶血时存在显著性影响，且溶血会影响HBV-DNA阳性标本检测准确性[24]。

TMA核酸检测技术是在等温条件下以双链DNA为模板直接转录出RNA，最后将扩增的产物——RNA通过杂交保护分析 （hybridization protection assay，HPA）进行化学发光检测，对于HPA，其采用的化学发光材料为吖啶酯 (Acridinium ester，AE)[10]。在碱性条件下，吖啶酯分子受到过氧化氢（H2O2）攻击可生成二氧乙烷，二氧乙烷不稳定，分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当其回到基态时会发出波长为430nm的光[25]。而Hb的最强烈光吸收主要是由血红素引起的，在近紫外光 和 可 见 光 主 要 有 578nm、540nm、416nm和342nm四条谱带（图2），而416nm的吸收强度比其它几条谱带高10倍以上[26]。由于TMA检测发出的信号波长430nm和Hb的最大吸收波长416nm很接近，如有微量Hb也可能对HPA带来极大的影响。TMA与核酸序列依赖性扩增（nucleic acid se-quence based amplification，NASBA）技术原理基本一致，而在NASBA方式进行的病毒NAT中，发现溶血对NAT有明显的抑制作用[27]。在用TMA技术对遗体捐献者的血液标本进行HIV检测时，也发现溶血对NAT有小而显著的影响，导致NAT检测，甚至重复检测都会无效[28]。

图2 Hb的吸收光谱

本研究表明，在Hb浓度≤40g/L时，溶血对TMA技术的核酸检测没有明显影响，其原因可能是在TMA的第一步靶核酸捕获中，会对没有结合到磁珠上的非靶核苷酸物质如Hb进行反复的洗脱，将结合病毒核酸分子的磁珠与样品中的其他成分分离，很大程度上消除了Hb的影响。此外，本研究所用的Procleix Ultro Plus试剂比Procleix Ultro试剂更为灵敏[29]，在成分上增加了强碱LiOH[30]，对蛋白质的变性作用更强，可进一步消除Hb的影响。

综上，本研究提示在实际的血液病毒核酸检测中，采用TMA技术的NAT在标本血浆Hb浓度≤40g/L时，标本溶血对核酸检测结果无显著性影响。这与其检测原理和所用试剂成分相关。但本研究尚有不足之处，测试标本量不够大、未与PCR检测原理的核酸检测系统进行平行对比、未考虑稀释样本浓度的溯源性，这些问题都有待进一步研究完善。