江西省2438例急性呼吸道感染儿童中人偏肺病毒感染分析

刘师文，李健雄，龚甜，张艳妮，施勇，肖芳，徐刚，周珺，刘晓庆，熊英

(江西省疾病预防控制中心疾病检测所，江西 南昌 330029)

2001年荷兰学者Vanden Hoogen等[1]从患急性下呼吸道感染的婴幼儿鼻咽抽吸物样本中分离到一种新的病毒，人偏肺病毒 (human metapneumovirus，HMPV)，随后在世界各地都发现该病毒的流行[2]。进一步研究表明，HMPV可导致各年龄组呼吸道感染，轻度的临床表现包括咳嗽，呼吸困难，喘息/喘鸣等，严重的症状包括支气管炎和肺炎伴随发热，在幼儿、老人、免疫功能低下人群还可引起致命的并发症[3]。

HMPV是属于副黏液病毒科偏肺病毒属的单股负链RNA病毒。基因组全长约13kb包含8个基因开放读码框架，其编码顺序为3`-N-P-M-FM2-SH-G-L-5`，编码9种蛋白，其中M2基因编码两种蛋白分别为M2-1、M2-2。9种蛋白分别命名为：N核衣壳RNA结合蛋白、P核衣壳磷蛋白、M非糖基化基质蛋白、F融合蛋白、M2-1转录延伸因子、M2-2 RNA合成调节因子、SH小疏水表面蛋白、G主要黏附蛋白、L主要多聚酶亚单位。对多个基因进化分析显示，hMPV分为A、B两个不同的基因型，每型内又可分为两个不同的亚型即(A1、A2和 B1、B2)[4，5]。 F基因表达的融合蛋白是 HMPV主要抗原，是目前分型最常用的基因[6]。本研究对江西省2010-2016年采集的急性呼吸道感染患儿标本进行HPMV核酸检测，并对阳性的样本进行F基因测序和分析，以了解江西地区HMPV流行情况和基因特征。

1 材料与方法

1．1 标本来源 于2010年4月至20106年12月每周二定点采集江西省儿童医院呼吸内科门诊和住院的急性呼吸道患儿的咽拭子或支气管灌洗液，并收集病例相关资料和临床信息。

1．2 主要试剂 病毒DNA和RNA提取试剂（QIAGEN），核酸扩增试剂盒（QIAGEN和Promaga Go-Taq Master Mix）。

1．3 样本处理和核酸提取 方法参照文献[7]。

1．4 HMPV 核酸检测（P基因） 引物 F 5’-TYAA CATTGCWACAGCAGGACC-3’，引物 R 5’-CTTC WGATTCWCCRCTTGTGCT-3’。 RT 反 应 ：50℃30min，95℃ 15min；PCR 循环如下：94℃ 30s，54℃30s，72℃ 1min， 共 扩 增 35 个 循 环 ，72℃ 延 伸10min。

1．5 HMPV F 基因扩增和测序 引物 Ff：5’-GTYA GCTTCAGTCAATTCAACAGAAG-3’，Fr：5’-CCTG TGCTGACTTTGCATGGG-3’。反应条件：RT反应：50℃ 30min，95℃ 15min；PCR 循环如下：94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 1min， 共扩增 35 个循环，72℃延伸10min。扩增产物送上海生物工程有限公司测序。

1．6 分析方法 采用SPSS 18．0软件对病例信息及检测结果进行卡方检验，P＜0．05为差异具有统计学意义。采用DNAStar和MEGA6．0软件F基因序列进行分析，以邻位相连法(neighbor-Joining，NJ)构建系统发生树。

2 结果

2．1 HMPV检测结果 2010年 4月至 2016年 12月，共采集2438例急性呼吸道感染患儿呼吸道标本，其中有54例患儿样本被检出HMPV核酸阳性，阳性率为 2．21%。

2．2 不同月份HMPV检测结果 1-12月不同月份HMPV阳性率经卡方检验，结果显示差异具有统计学意义（χ2=35．723，P=0．000188＜0．05），其中发病季节主要为冬春季，高发月份为12月、1月、2月、3月。见表1。

表1 不同月份HMPV核酸检测情况

2．3 HMPV感染儿童年龄分布 从病例年龄分布看0～5岁病例共49例，占总病例数90．74%，不同年龄组之间HMPV阳性率经卡方检验，差异无统计学意义（χ2=12．876，P=0．302＞0．05）。 见表 2。

表2 不同年龄组HMPV检出情况

2．4 不同性别患儿HMPV检测结果 不同性别HMPV 阳性率差异无统计学意义 （χ2=0．394，P=0．530＞0．05）。 见表 3。

2．5 江西地区HMPV基因型分型 对54份HMPV阳性样本进行F基因扩增测序，最终成功获得28株病毒的F基因序列，应用MEGA6．0和 DNA STAR软件包进行序列分析，根据分析结果进行基因分型，其中21株为A2基因型，B1基因型3株，B2基因型4株，系统发生树见图1。

表3 不同性别组HMPV检出情况

图1 江西地区HMPV流行株F基因片段邻位相邻法系统发生树（613-1064bp）。

3 讨论

人类偏肺病毒可导致人类上呼吸道和下呼吸道感染，尤其是在小于5岁婴幼儿、老人和免疫力低下者中引起细支气管炎和肺炎[8]，在下呼吸道感染中，仅次于呼吸道合胞病毒[4]。该病毒自2001年首次被发现以来受到了国内外广泛关注。我国2003年朱汝南[9]等首先报道了国内HMPV感染情况，之后，国内其他等地相继也有类似报道[10-12]，但目前还未见江西地区该病毒感染情况的研究报道。本研究对2010-2016年江西地区采集的2438例儿童急性呼吸道本进行了HMPV核酸检测，检出阳性54例，阳性率为2．21%，说明它确实是引起江西地区儿童急性呼吸道感染的重要病原之一。阳性病例在各个不同月份间人偏肺病毒检出率差异具有统计学意义，主要流行月份在12月和1-3月，流行季节为冬春季，结果与金玉报道的相符[13]；本研究中，小于5岁总病例数90．74%；分析未发现该病毒在两性别间的感染有显著差异，结果与徐梅佳[14]的报道相符。

HMPV分为A、B两个不同的基因型，每型内又可分为两个不同的亚型即(A1、A2和 B1、B2)，有研究表明，两种hMPV基因型可在同一季节里共同流行，且以A基因型为多，hMPV基因型的流行模式在同一区域的不同年份可能不断变化；朱汝南[9]报道2003年和2004年北京地区流行的hMPV分属于两种基因亚型（A2和B2），湖南地区hMPV样本分属于四种亚型（A1、A2、B1、B2），且以 B 基因型为多[15]。本研究共测序获得28株人偏肺病毒的F基因序列，系统进化分析显示，江西地区流行的人偏肺病毒有A2、B1、B2基因型，A2基因型毒株每年都有检测到，我们推测A2基因型毒株为江西本土的优势流行株。不同基因型与临床表现的关系我们还需进一步的研究。

综上所述，本研究证实hMPV是引起江西地区儿童急性呼吸道感染的重要病原之一，掌握了江西地区的hMPV流行规律及基因分型特征，对提高江西地区人偏肺病毒的防控有重要意义。