基于MLST鄱阳湖微囊藻的遗传多样性及其系统发育

柳满森,蔡芳芳,王一郎,霍 达,虞功亮,李守淳*,李仁辉*

基于MLST鄱阳湖微囊藻的遗传多样性及其系统发育

柳满森1,蔡芳芳2,3,王一郎2,3,霍 达2,3,虞功亮2,李守淳1*,李仁辉2*

(1.江西师范大学生命科学学院,江西 南昌 330500；2.中国科学院水生生物研究所藻类生物学重点实验室,湖北 武汉 430072；3.中国科学院大学,北京 100049)

为了研究鄱阳湖微囊藻的遗传多样性及其系统发育关系,基于7个管家基因(Z、A、X、B、、A和),建立了一个多位点序列分型( MLST)方法.对来自鄱阳湖的20株微囊藻分离株进行MLST研究,并构建本地微囊藻MLST基因库.结果表明:这20株藻株具有20种独特的序列型(STs),揭示了微囊藻高水平的遗传多样性(=0.986).基于7个MLST位点串联序列的系统发育分析显示,微囊藻藻株序列型可分为5个不同的组.与之前日本湖泊研究的237个STs共建的系统发育树比对表明,本研究的STs形成了独立的分枝.该结果说明不同地区的微囊藻是相对稳定的,因此可以用MLST进行明确的表征.

水华；微囊藻；MLST；遗传多样性；鄱阳湖；系统发育

微囊藻()是淡水环境中最常见和分布最广泛的水华蓝藻种类[1].微囊藻水华暴发会导致一系列环境问题[2-3].其对水环境污染和人类饮水健康的影响成为人们关注的焦点和热点[4].微囊藻是一类能形成群体的单细胞蓝藻,在富营养化的淡水环境大量繁殖.根据传统的形态学分类,微囊藻属内有10多个常见的种[5].但是由于微囊藻群体形态特征高度可变,而且这种变化有时会超过形态学分类标准,因此微囊藻属种水平分类也被提出过异议.根据细菌分类学方法,单个基因序列如16S rRNA基因序列以及16S~23S之间的ITS序列由于保守性很强,并不能将微囊藻属内的种很好地区分开来[6].近年来,微囊藻许多藻株的全基因组测序结果显示,尽管不同藻株特有基因占比很大,但是核心基因的相似度仍能很高[7].多位点序列分型(MLST)是通过分析多个管家基因序列,对不同微生物株系的等位基因进行多样性比较,不同的株系对应不同的序列型.所以MLST方法越来越多地作为微生物株系间多样性比较的工具,也常常应用于生物进化和种群结构的研究.实际上MLST是介于单基因和全基因组之间的有效而又含有足够遗传信息量的分析方法,但是在蓝藻的遗传多样性研究中,只有日本学者利用MLST对日本湖泊中分离的微囊藻藻株进行过遗传多样性和基因重组研究[8-9],世界其它地区未见报道.我国已经成为一个微囊藻水华暴发频繁和暴发范围广泛的国家,对我国微囊藻藻种的多样性研究是迫切需要的.

鄱阳湖是我国第一大淡水湖,水文环境复杂,但是近年来的环境变化使鄱阳湖每年形成蓝藻水华.本研究从鄱阳湖分离获得了20株微囊藻并采用MLST方法对这20株微囊藻进行遗传多样性及系统发育研究,以期揭示其群体遗传多样性,探究管家基因及对应产毒株的分型,探讨不同地区微囊藻遗传多样性的差异.这是国内首次使用MLST方法研究微囊藻遗传多样性、产毒株分型及系统发育分析.

1 材料与方法

1.1 藻株分离与培养

本研究的20株微囊藻藻株经过形态学鉴定,分属于4个形态种:11株铜绿微囊藻(),3株惠氏微囊藻(),3株鱼害微囊藻(),3株绿色微囊藻().这些藻株均是采用经典毛细管分离法分离自鄱阳湖,所有藻株分离纯化后转移至装有5mL含有无菌MA培养基的玻璃试管中培养,培养条件为温度25℃,光照强度30 μmol protons/(m2·s),光照周期为12h/12h(光:暗)[10].

1.2 微囊藻藻株MLST

MLST采用7个管家基因,分别为Z,A,X,B,,A,.每个基因座都是以单拷贝形式存在.使用传统CTAB法提取所有微囊藻藻株DNA,通过PCR进行扩增,7个管家基因的引物如表1,PCR扩增体系为50μL,反应条件为:94℃预变性3min, 94℃变性60s,60℃退火30s,72℃延伸30s,此3个过程为35个循环,接着72℃终延伸5min.PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后,将对应阳性条带切下,并使用BioFlux试剂盒进行回收.产物回收后构建质粒载体,转化大肠杆菌DH5α,并挑选阳性克隆进行测序,最终将得到的序列去接头.查阅相关文献[8-9,11],利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载相关基因座序列,构建微囊藻MLST本地基因库,将本研究序列与本地基因库进行比对,对于每个基因座,每个不同的等位基因都被分配一个不同的任意数字,而7个等位基因的唯一组合明确地定义了一个藻株的序列类型(ST).

1.3 毒素基因检测

使用引物EF2和ER4(如表1),检测微囊藻毒素合成基因E,退火温度为55℃,其余条件与扩增管家基因相同.并采用酶联免疫反应检测扩增出E基因潜在产毒株的毒素含量.

表1 MLST中使用的PCR引物序列与mcyE基因PCR引物序列

1.4 遗传学与系统发育分析

使用软件DNAsp分析DNA遗传多样性指数,公式如式(1):

(=[/(-1)](1-∑2) (1)

式中:是样本数量,p是第个等位基因的相对频率.

同时分析核苷酸多样性[12],和基于田岛的中性测试[13].系统发育分析使用SequenceMatrix v1.7.8将7个基因按Z-A-X-B--A-的顺序串联起来;使用CLUSTAL X v2.0将序列比对裁剪对齐;使用MODELTEST v3.7[14]和PAUP* v4.0b10[15],推断模型和计算参数,推断出的最佳模型为GTR+I+G;使用MEGA v7构建邻接树(NJ);使用IQ-tree 构建最大似然树[16];最后使用Figtree v1.4.3对获得的系统发育树进行编辑.

2 结果与分析

2.1 MLST

采用表1所示的引物均成功从20株微囊藻中扩增得到7个MLST基因片段.与构建的微囊藻MLST本地基因库进行比对,分型.确定了20个不同的ST型(ST238-ST257)如表2所示,每株藻都各自代表了不同的STs,LMS01-LMS20来源于鄱阳湖的不同区域,分别为修水口5株,湖口及主航道3株,老爷庙水域3株,蚌湖水域8株,青岚湖1株(表2).结果说明本研究所采用的7个管家基因可有效的对微囊藻藻株进行分型,同一地点与不同地点均有很高的遗传多样性.

表2 20株鄱阳湖微囊藻藻株的序列型及对应的等位基因编号

2.2 遗传多样性

表3 基因多样性指数

注::等位基因数;:基因多样性;:核苷酸多样性; **:<0.01极显著; *:<0.05显著

测序序列去除两端载体序列后,在任何位点的序列中均未发现插入或删除,因此序列可以明确对齐.由DNAsp 软件计算的遗传多样性指数如表3所示.基因片段长度在440~502bp不等,平均总核苷酸离散度(×100)为29%,最大值为的31.8%,最小值为X的27.7%,ST等位基因数从X的16到B的19不等,7个基因座的平均基因多样性为0.986. tajima’值则表明了显著的相关性.

2.3 毒素基因检测结果

以微囊藻毒素E为扩增目标的一对引物检测鄱阳湖20株微囊藻藻株的潜在毒性[16].通过扩增E基因,11株微囊藻发现了毒素基因,9株未发现毒素基因.对扩增的毒素基因进行测序后blast比对,所有结果均为阳性.对潜在产毒微囊藻藻株进行酶联免疫反应检测,结果表明:11株潜在产毒株中有8株检测到了毒素.最终,20株微囊藻藻株中,8株为产毒株,3株有毒素基因但不产毒株,9株不具备产毒基因(图1).

图1 基于7个MLST位点的串联序列20株微囊藻邻接系统发育树

A组代表有毒素基因的无毒株,B、C组代表产毒株,D组代表无毒株,E组代表产毒株与无毒株混合组

2.4 系统发育分析

单个MLST基因系统发育分析无法解决系统发育关系的置信度.因此,本文连接了7个MLST基因序列,获得了总长为2992bp的序列[17].使用MODELTEST软件进行分层似然比检验,进行多位点串联序列进化分析,结果显示:最优模型为GTR+ I+G,ATCG,4种碱基的频率分别为0.2511,0.2647, 0.2385,0.2458.替代模型速率矩阵为()[-]= 0.9718,()[-]=2.2497,()[-]=1.0052,()[-]=1.1882,()[-]=2.1818,()[-]=1.0000. 从选定的模型和参数推断出的邻接系统发育树(图 1)可看出藻株之间的关系能够得到明显的体现,20 个序列型分为2个大枝,把步展值大于90的分为同一组,可以分为5个组,D组为无毒株,除此之外,还有ST242,ST254,ST257和ST239为单枝上的无毒株,A组为有毒素基因的无毒株,另有一株与无毒株ST239聚在了一起,B组C组均为产毒株,而E组同时包含产毒与无毒株,这一组独立于其他4个组.

形态学鉴定结果显示:ST238、ST243、ST247为绿色微囊藻,其中ST243、ST247在系统发育树中的B组,ST238在E组,均为产毒株:ST239、ST241、ST244、ST245、ST246、ST248、ST250、ST251、ST252、ST254、ST256为铜绿微囊藻,分散在A、C、D、E组,产毒株,不产毒株,有毒素基因不产毒株均有分布:ST240、ST249、ST255为鱼害微囊藻,其中ST240、ST249在E组,为产毒株,ST255在A组,为有毒素基因的无毒株:ST242、ST253、ST257为惠氏微囊藻, ST242、ST257存在于单枝上,ST253在D组,3株均为无毒株.

从采集位点看,修水口5株藻株位于系统发育树的单枝及E组:主航道3株藻株位于B、E组,蚌湖水域8株藻株在各组中均有分布,青岚湖1株藻株位于单枝上,老爷庙水域3株藻株位于单枝及A组.

3 讨论

3.1 微囊藻高遗传多样性

微囊藻遗传多样性研究可以使用多种方法进行,本研究MLST方法分析我国微囊藻藻株的遗传多样性,这种方法在细菌特别是病原菌株系方面已有较多研究.虽然本次研究的微囊藻藻株有限,分离地点也具有随机性,但结果仍表明,鄱阳湖的微囊藻藻株具有很高的遗传多样性.所有基因座具有高分子多态性,每个基因座至少包含19个等位基因点,平均基因多样性为0.986,这远远高于大肠杆菌(= 0.39)[18],枯草芽孢杆菌(=0.44)[19],也高于日本的微囊藻藻株(=0.951)[8].鄱阳湖微囊藻高水平的遗传多样性,可能是微囊藻包含多个不同的生态类型,这也反映出鄱阳湖包含许多不同的生境,这些生境差异往往会伴随遗传差异.如果一个物种存在更多的生态类型,那么这个物种就会保持更高的遗传多样性[20],随着时间的推移,每个生态型都有属于自己基于基因序列的分枝.微囊藻系统发育树中观察到许多不同的分枝,这表明每个分枝可能代表一个特有的生态型.

3.2 产毒与不产毒藻株系统发育关系

MLST结果显示,产毒株和不产毒株在MLST等位基因谱上存在差异,本文构建邻接系统发育树,探讨产毒株与不产毒株的系统发育关系.如图1可以看出,B组和C组均为产毒株,而在E组中,同时出现了产毒与无毒株,这些不一致基因型的存在可能使E基因功能丧失,突变或是异位[21].在微囊藻中,气囊基因也曾报道过基因功能丧失[22].在A组中,拥有E基因却不产毒,通过比对E基因序列发现,B组E序列与其他产毒序列都有差别,相对于产毒序列,它含有碱基差异.虽然我们还没有发现这一突变是否与微囊藻毒素丢失直接相关,但已有报道称碱基差异会使微囊藻的产毒株演变为无毒株[21,23-24].而另一个认为藻株无毒的原因可能是,这些藻株中产生的微囊藻毒素浓度过低,无法通过ELLSA检测到,但是本文取对数生长期的微囊藻培养液,稀释梯度倍数,进行检测,结果是可信的.

本研究中16S rRNA基因序列无法有效的区分产毒株与不产毒株.有大量研究表明微囊藻16S rRNA基因高度保守,超过99.5%的序列相似度,无法进行种水平鉴定.本研究的鄱阳湖的微囊藻藻株的16S rRNA 基因序列结果和大量研究结果类似,也是大于99.5%,并且MLST与16S rRNA系统发育与多位点序列分型无相关性.同样,形态学鉴定结果与系统发育树比较,结果表明,绿色微囊藻均产毒,惠氏微囊藻均不产毒,鱼害微囊藻与铜绿微囊藻两者都有,所有藻株分散于不同组中,与产毒分型没有显著的相关性.大量证据表明微囊藻各形态种产毒比例为绿色微囊藻>铜绿微囊藻>鱼害微囊藻>惠氏微囊藻,与本研究的结果相同.

3.3 微囊藻MLST系统发育树

本研究20个微囊藻藻株分布于鄱阳湖不同水域,蚌湖水域采集藻株较多,在每组中均有分布,其他水域采集藻株较少,分散于不同组,结果表明:使用多位点分型无法有效的对鄱阳湖藻株进行分型,本文认为是鄱阳湖水文环境复杂,水体交换频繁,不同水域微囊藻具有迁移的可能性.而使用鄱阳湖20个藻株与日本湖泊237个藻株,构建邻接系统发育树(图2).结果显示:本研究的19株(ST242例外),完全独立于日本湖泊的藻株.尽管本文采用了7个管家基因,相对保守,构建的系统树却形成了明显的分支.有研究表明时空变化会导致基因的差异,长时间的地理差异进化,会形成地理隔离[25].日本湖泊与中国鄱阳湖有着较大的地理差异,因为日本湖泊基本是处于温带,而鄱阳湖则处于亚热带.所以可能是生态环境的差异是引起两者独立成枝的重要因素之一.当微囊藻株存在地理差异时,必须考虑到细微的时空遗传变异,这为进一步研究更大样本、更好地纳入环境变量的微囊藻的微进化以及进一步了解微囊藻的环境适应提供了基础.

图2 基于鄱阳湖与日本湖泊的微囊藻藻株ST型的系统发育树

由于生态与环境的重要性,一个可靠的基因分型方法能为监测控制微囊藻水华提供基础.本文使用的MLST方法,已经证明可以用它来明确地描述克隆的基因型.事实上,MLST可以区分超过5500亿个多位点基因型[26],具有高分辨率.因此期望MLST适用于全世界的微囊藻等蓝藻的DNA序列分型.MLST的结果可比较,很容易与其他研究人员的研究结果相结合,因此MLST将成为研究微囊藻全球种群结构的一个非常有价值的工具.在本文中,使用MLST方法对鄱阳湖微囊藻藻株DNA分型,证明了它们较高的遗传多样性,通过系统发育分析识别出产毒株和无毒株[27].今后通过更广泛更集中的藻株检测,构建更庞大的MLST数据库,这对其产毒株分型及种群遗传学,如基因流、自然选择等的研究定有很大的帮助.

4 结论

4.1 鄱阳湖20株微囊藻确定了20个不同的STs.

4.2 微囊藻多位点基因序列长度在440~502bp不等,平均核苷酸离散度为29%,平均基因多样性指数为0.986.

4.3 20株微囊藻通过系统发育分析,可以分为5个组,A组为有毒素基因的无毒株,另有一株与无毒株ST239聚在一起,B组C组均为产毒株,D组为无毒株, ST242,ST254,ST257和ST239为单枝上的无毒株,而E组同时包含产毒与无毒株,这一组独立于其他4个组.

4.4 基于7个串联基因系统发育关系表明,鄱阳湖微囊藻的20个STs,基本上独立于日本湖泊微囊藻的237STs(ST242除外).

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Genetic diversity and phylogenetic analysis ofin Poyang Lake based on MLST.

LIU Man-sen1, CAI Fang-fang2,3, WANG Yi-lang2,3, HUO Da2,3, YU Gong-liang2, LI Shou-chun1*, LI Ren-hui2*

(1.Colege of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330500, China；2.Key Laboralory of Algae Biology,Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China；3.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)., 2019,39(7)：3081~3087

Using the multilocus sequence typing (MLST) based on seven housekeeping loci (Z,A,X,B,,A and), twentystrain isolated from Lake Poyang, the largest freshwater Lake in China, were examined to study their genetic diversity and phylogenetic relationship. The MLST revealed the 20 unique sequence types (STs) for these 20strains and their higher genetic diversity with H value as 0.986.The phylogenetic analysis based on the seven gene sequences showed that Microcystis strains were divided into five different groups, Phylogenetic tree based on the STs from our research and Japanese lakes revealed that our STs formed the independent branch, indicating that microcysts from different areas is relatively stable. So it can be clearly characterized by MLST.

water bloom；；MLST；genetic diversity；Poyang Lake；phylogeny

X524

A

1000-6923(2019)07-3081-07

柳满森(1993-),男,汉族,甘肃兰州人,江西师范大学硕士研究生,主要从事分子生态学方向的研究.发表论文1篇.

2018-12-17

国家自然科学基金(41561005);江西省自然科学基金(S2019ZRMSB0218)

* 责任作者, 李守淳, 教授, lisc@jxnu.edu.com;李仁辉, 研究员, reli@ihb.ac.com