复苏周期单囊胚移植的胚胎选择策略

夏梦，董娟，马龙，曾桥，吴春香，蔡令波，刘金勇，刘嘉茵

(南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心，南京医科大学生殖医学国家重点实验室，南京 210029)

辅助生殖技术发展四十年来，随着临床促排卵方案的优化和胚胎培养技术的提高，IVF-ET的成功率已显著升高。为了降低多胎率，提高着床率，囊胚培养和移植技术在临床上得到越来越多的重视，尤其是单囊胚移植技术的应用越来越广泛。

胚胎基因组激活是在第3天8细胞期后[1]，胚胎基因组从母体型转变为胚胎型时才能真正评估胚胎发育潜能。囊胚培养允许胚胎得到自然筛选，可在胚胎基因组激活之后挑选高质量的胚胎。囊胚阶段移植，胚胎发育与子宫内膜发育同步，可以提高胚胎种植率及妊娠成功率，从而实现单个囊胚移植，降低多胎妊娠率[2-3]。

随着商业化培养体系的不断优化，人类囊胚培养成功率和囊胚质量得到提高[4-5]。囊胚质量可直观反映胚胎发育潜能，是行单囊胚移植首要考虑的关键因素。目前囊胚的形态学评分通常采用Gardner & Schoolscraft评分系统[6]，但在实际单囊胚移植的胚胎选择时，内细胞团、滋养层细胞二者的评分可能并不平行，选择内细胞团最佳的囊胚还是选择滋养细胞层最佳的囊胚进行移植，国内外文献尚有异议[7-8]。本研究探讨复苏周期中囊胚质量对于单囊胚移植策略选择的影响，旨在为单囊胚移植提供直接的临床依据。

资料和方法

一、研究对象

从辅助生殖管理系统(CCRM)数据库调取2015年1月至2017年12月期间在本院生殖中心完成的囊胚移植复苏周期共4 668个，回顾性分析各项数据。患者纳入标准：(1)女方年龄<40周岁；(2)子宫内膜厚度在7～14 mm之间；(3)囊胚培养冻存的新鲜周期使用常规促排卵方案；(4)复苏后囊胚扩张且为单个囊胚移植周期。排除标准：(1)新鲜囊胚移植；(2)卵子捐赠囊胚培养冻存周期；(3)囊胚解冻后皱缩状态移植周期；(4)失访周期。

二、研究方法

1.促排卵及囊胚培养：所有研究对象采用的超促排卵方案按本中心常规进行，获卵后根据患者情况采用常规IVF授精或行单精子卵胞浆注射，在受精后的第3天根据胚胎评分情况挑选1～2枚优质胚胎移植或冷冻，剩余胚胎经患者知情同意后进行囊胚培养，第5～6天将发育成囊胚的胚胎进行冷冻保存。择期行复苏周期单囊胚移植。本研究4 668例患者均签署囊胚培养知情同意书及胚胎冷冻协议。

2.囊胚评分方法：本中心囊胚评分采用Gardner & Schoolscraft评分系统[6]。

根据囊腔扩张程度分为1～6个时期。1期：早期有腔囊胚，囊胚腔小于胚胎总体积的1/2；2期：囊胚腔体积大于或等于胚胎总体积的1/2；3期：完全扩张囊胚，囊胚腔完全占据胚胎；4期：囊胚腔完全充满胚胎，体积大于早期胚胎，透明带变薄；5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分开始从透明带中孵出；6期：孵出囊胚，囊胚全部从透明带中孵出。

处于3～6期的囊胚，根据内细胞团和滋养外胚层细胞的质量各分为3级。内细胞团分级：A级：细胞数目多，结合紧密；B级：细胞数目少，结合松散；C级：细胞数目很少。滋养层细胞分级：A级：细胞数量多，形成紧密排列的上皮细胞层；B级：细胞数量少，排列松散；C级：极少数的大细胞。本中心仅对4～6期且BC或CB级别以上囊胚进行冷冻，CC级别予以废弃。

3.囊胚冷冻与复苏：本中心采用COOK玻璃化冷冻及解冻试剂盒(Cook，K-SIBW-5000，美国)。将囊胚进行人工辅助皱缩囊腔，将囊胚腔液释放，随后在37℃热板下进行冷冻。4.6 ml V2加入0.4 ml DMSO配成冷冻用V2液体(浓度为0.8 mmol/L)，4.2 ml V3加入0.8 ml DMSO配成冷冻用V3液体(浓度为1.6 mmol/L)。将胚胎移入V1液体中1 min，后移入冷冻V2液体中平衡3 min，观察胚胎皱缩及恢复情况，再移至冷冻V3液体中30 s，并在1 min内装载并投入液氮内。解冻操作在37℃下进行，胚胎在1 mol/L蔗糖内平衡1 min左右，根据胚胎情况依次移至解冻T1液体5 min，T2液体5 min及T3液体5 min，后移至预先平衡好的囊胚培养液中继续培养。复苏后4～6 h在倒置显微镜(Nikon，日本)下观察囊胚恢复情况，经B超引导下行宫腔内胚胎移植术。

4.复苏周期内膜准备及囊胚移植：患者采用人工周期或自然周期准备子宫内膜。自然周期：用于月经规律，排卵正常的患者。于月经周期第10～12天开始B超监测排卵，排卵前注射HCG(珠海丽珠制药)5 000 U，监测到排卵后常规黄体支持。人工周期：用于排卵障碍者。于月经周期第2～4天常规B超检查，口服戊酸雌二醇(补佳乐，先灵，德国)4～6 mg/d，B超监测当内膜厚度≥8 mm时常规黄体支持。黄体支持第5天在B超引导下行胚胎移植，每周期移植1枚复苏且扩张囊胚，移植后继续黄体支持。

5.移植妊娠与妊娠结局的判断：移植后14 d检测血β-HCG，若为阳性在移植后4周B超检查，超声下见原始心管搏动及孕囊判定为临床妊娠。妊娠12周内胚胎停止发育或发生妊娠物排出则诊断为早期流产。妊娠满28周且至少有1个存活新生儿分娩定义为活产。随访至胎儿出生，并记录妊娠患者分娩情况及胎儿情况。

三、统计学分析

结 果

一、单囊胚移植妊娠结局

本研究共4 668个复苏周期，每周期移植1枚囊胚。临床妊娠率为78.23%，活产率为67.33%，流产率为13.94%。

二、囊胚冻存前发育天数对妊娠结局的影响

D5与D6囊胚移植患者的基本情况分析显示，两组年龄、不孕年限、不孕类型、BMI、基础FSH水平、子宫内膜厚度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。但D5囊胚移植临床妊娠率及活产率均显著高于D6囊胚移植，且流产率显著低于D6囊胚移植(P<0.05)(表1)。

三、囊胚腔扩张程度对妊娠结局的影响

重新扩张是囊胚有继续发育潜力的标志(图1)。对复苏后4～6期囊胚移植妊娠结局进行分析，移植前囊胚腔扩张程度与临床妊娠率及活产率无显著相关性(P>0.05)(表2)。

四、不同囊胚级别对妊娠结局的影响

4～6期可移植囊胚根据内细胞团和滋养层细胞形态分为AA、AB、BA、BB、BC及CB级别(图2)。除去囊胚腔扩张程度的影响，各级别囊胚移植妊娠结局比较结果显示：优质囊胚(包括AA、AB和BA级)均有较高的临床妊娠率和活产率，整体上优于非优质囊胚(BB、CB、BC)(P<0.05)。AA级别囊胚临床妊娠率(86.86%)和活产率(78.11%)最高，而流产率(10.08%)最低；相较于AB级别，BA级别临床妊娠率和活产率较高，而流产率较低(P<0.05)。非优质胚胎中，BB级囊胚临床妊娠率和活产率均优于BC和CB级囊胚(P<0.05)，而流产率无显著差异(P>0.05)；BC级别与CB级别囊胚移植临床妊娠率和活产率无显著性差异(P>0.05)，但CB级别囊胚流产率显著降低(P<0.05)(表3)。

组 别周期数平均年龄不孕年限[M(P25,P75)]BMI(kg/m2)基础FSH(U/L)D5囊胚组3 63029.55±4.093.00(2.00,5.00)22.30±2.877.27±3.16D6囊胚组1 03830.28±4.283.00(2.00,5.00)22.34±5.747.02±3.29组 别周期数内膜厚度(mm)临床妊娠率活产率流产率D5囊胚组3 6309.41±1.5280.85(2 935/3 630)70.28(2 551/3 630)13.08(384/2 935)D6囊胚组1 0389.17±1.9969.08(717/1 038)*57.03(592/1 038)*17.43(125/717)*

注：与D5囊胚组比较，*P<0.05

图1 4～6期囊胚镜下形态(×400)

表2 4～6期囊胚妊娠结局比较(%)

图2 各个级别囊胚的镜下形态(×400)

五、内细胞团(ICM)和滋养细胞层细胞(TE)评分对妊娠结局的影响

对4～6期扩张囊胚进一步探讨不同级别内细胞团和滋养细胞层细胞分别对临床妊娠结局的影响。结果显示，当不考虑滋养层细胞形态，内细胞团级别越高，临床妊娠率和活产率越高(P<0.05)，而流产率与之未显示出统计学相关性(P>0.05)；当不考虑内细胞团形态，滋养层细胞级别越高，临床妊娠率和活产率越高，且流产率越低(均P<0.05)(表4)。

表3 各级别囊胚移植妊娠结局比较(%)

注：与非优质囊胚各组临床妊娠率及活产率比较，*P<0.05；与AB组比较，#P<0.05；与BB组比较，$P<0.05；与BC组比较，&P<0.05

表4 ICM和TE评分对妊娠结局的影响(%)

注：与ICM-A组比较，*P<0.05；与ICM-B组比较，#P<0.05；与TE-A组比较，ΦP<0.05；与TE-B组比较，ΔP<0.05

讨 论

关于复苏周期囊胚，发育潜能的评估意义重大。本研究结果显示D5囊胚比D6囊胚在妊娠率和活产率指标方面具有显著的优势。内细胞团和滋养细胞层细胞形态均是预测活产率的重要评价指标，尤其对于优质囊胚，滋养细胞层细胞级别高的囊胚流产率明显降低，在胚胎发育更早期阶段为持续妊娠建立基础。

囊胚阶段移植，胚胎的发育与子宫内膜发育同步，可以提高胚胎种植率及妊娠成功率，同时可以减少胚胎移植的数量和减少多胎妊娠的发生。通过淘汰发育潜能不良的胚胎，筛选出更好的移植胚胎。而要实现单胚胎移植特别是单囊胚移植，首先必须要改善培养条件提高囊胚形成率。另一方面是必须要有可靠和简便的冷冻保存方法，保证剩余胚胎能安全的冻存，以确保患者的累积妊娠率。序贯培养体系的不断完善显著提高了囊胚形成率。同时自2000年Yokota等[9]报道了世界首例玻璃化冷冻复融移植获得妊娠的病例以来，冻融胚胎移植发展迅速。2006年国内报道玻璃化冷冻囊胚的复苏率达90.4%，临床妊娠率达73.7%[10]。这两方面成为单囊胚移植实现的基础。

掌握预测活产率的评价指标，可为单个囊胚挑选移植提供临床依据。有研究显示，D5囊胚复苏率、种植率及活产率均显著高于D6囊胚，认为囊胚形成的时期是妊娠结局的重要相关因素。针对小于37岁女性病例的分析发现，相较于D5囊胚移植，D6单囊胚胚胎移植流产率显著增高(21.7% vs.12.3%)[11]。本研究结果表明，复苏周期中囊胚形成的发育天数影响妊娠结局，D5囊胚移植的临床妊娠率和活产率均显著高于D6囊胚，且D5囊胚移植流产率也较低(P均<0.05)，而两组患者的平均年龄、不孕年限、BMI、基础FSH等情况差异均无统计学意义(P>0.05)。D6囊胚在发育上较D5囊胚有所延迟，即使扩张充分、质量较好的D6囊胚由于囊胚细胞数增加，必然会有更多的新陈代谢活动和更大的囊胚腔，这些因素都可能影响玻璃化冷冻复苏的过程和结果。与D6囊胚相比，冷冻过程似乎对D5囊胚细胞DNA的损伤更少，这可能是D5囊胚质量优于D6囊胚的内在原因之一。有文献推测D6囊胚延长体外培养时间，非整倍体率更高[12]，从而增加早期流产率，相关机制还有待进一步研究。由此在排除囊胚分期和分级的基础上，相对于D6囊胚，选择D5囊胚复苏移植可显著优化妊娠结局。

囊胚腔扩张程度、内细胞团和滋养层细胞评分均是预测活产率的重要形态学评价指标[13-15]。有研究显示，冷冻前囊胚腔扩张程度与临床妊娠率及活产率相关，每扩张一个等级，活产率较原基础增高36%；而复苏后囊胚腔每再扩张多10%体积，活产率较原基础增高39%[16]。冷冻复苏后，囊胚再扩张程度显示生殖发育潜能[17-18]，囊胚重新扩张的时间越早，其发育潜力越好，移植后妊娠几率越高。本研究为排除复苏后皱缩或未完全扩张等重新扩张程度相关的干扰因素，病例均采用复苏后4～6 h内囊胚腔完全扩张的4～6期囊胚进行移植。结果显示，囊胚扩张程度与临床妊娠率及活产率无显著相关性，而流产率有增高趋势但无统计学意义(P>0.05)。可见对于完全扩张的囊胚，内细胞团和滋养层细胞形态学评分比囊胚分期对于判断囊胚移植妊娠结局的意义更为重要。

在人类囊胚的发育过程中形成了胚胎的首次细胞分化，分别形成内细胞团和滋养细胞层细胞。内细胞团日后发育为胎儿，滋养层细胞发育为胎盘。在目前采用的Gardner囊胚形态学评分系统中，囊胚腔扩张程度、内细胞团和滋养层细胞均是临床妊娠结局相关的重要评价指标，且三者评分具有独立性。已有文献证实内细胞团的大小和形态对于着床有明显的预测价值[19-20]，移植内细胞团评分高的囊胚妊娠结局更好；也有相关研究表明，在新鲜囊胚移植周期中，并非内细胞团而是滋养细胞层细胞分级与胚胎种植率和活产率呈正相关[16，21]。

我们对4～6期扩张囊胚进一步探讨内细胞团和滋养细胞层细胞作为独立因素对临床妊娠结局的影响。结果显示，随着内细胞团评分增高临床妊娠率和活产率也有上升趋势，但流产率却无相关变化；而滋养细胞层细胞评分则呈现与活产率和流产率都更为紧密的显著相关趋势。因此内细胞团与滋养细胞层细胞都是评价活产率的预测指标。而滋养细胞层细胞对于流产率的提示意义，可能与滋养细胞层细胞在囊胚种植早期阶段发挥重要作用相关，如HCG信号调节、透明带孵出、内膜附着，以及与母源性免疫系统的联系等[22-23]。

本研究显示，囊胚扩张程度与妊娠结局并无显著相关，内细胞团评分与临床妊娠率和活产率呈显著相关，而仅有滋养细胞层细胞是活产率相关的独立预测指标。但复苏周期单囊胚移植的选择是综合了内细胞团和滋养细胞层细胞的双重评价标准[24-25]。我们的研究结果显示，对于优质囊胚(AA、AB、BA级别)，AA级别囊胚妊娠结局最佳，BA级别囊胚的临床妊娠率和活产率都高于AB级别，且流产率较低；同时也验证了之前TE-A组囊胚活产率高于TE-B组，且流产率低于TE-B组的结果。对于非优质囊胚(BB、BC、CB级别)，BB级别囊胚妊娠结局优于BC和CB级别囊胚，CB级别流产率低于BC级别囊胚，亦验证了TE-B组囊胚流产率低于TE-C组，但BC级别妊娠率和活产率优于CB级别的结果。值得注意的是，BC组有412例而CB组仅有 136例，样本量相对较少可能会影响统计学差异性。需要进一步扩大样本量继续观察。

本研究主要运用传统的形态学评分方法评价胚胎质量，具有一定局限性。近来有文献表明，其他评估胚胎质量的方法可能会改善辅助生殖的结局[26]。例如目前很多中心开展Time-lapse 实时监测系统，可对胚胎形态学和动力学进行更全面的评估[27-28]。另有研究表明，对滋养细胞层细胞质量的精确评价与囊胚种植潜能及性别筛选显著相关[29]。形态学和非形态学的评估胚胎质量的方法仍在不断发展，将对改善辅助生殖的临床结局起到重要作用。

综上所述，选择D5囊胚复苏移植可显著优化妊娠结局。对于完全扩张的囊胚，相比囊胚分期，内细胞团和滋养细胞层细胞分级是临床妊娠率和活产率更为密切的预测指标。本研究进一步证实了滋养细胞层细胞级别高的囊胚流产率低，相较于内细胞团，滋养细胞层细胞在胚胎发育更早期阶段为持续妊娠建立基础。对于优质囊胚而言，滋养细胞层细胞对于囊胚种植潜能的影响具有更加重要的意义。以上研究结果为单囊胚的复苏移植提供了筛选依据。