MTHFR基因多态性在台州地区原发性男性不育症中的研究

徐佳佳，陈文举，梁玲芝，楼永良

(1.温州医科大学检验医学院 生命科学学院，温州 325000；2.台州市中心医院检验科，台州 318000)

目前全世界约有10%～15%的育龄夫妇不育，其中男性因素占50%[1-2]。男性不育病因复杂，遗传因素是原发性男性不育的主要原因之一。5，10亚甲基四氢叶酸还原酶 (Methylene tetrahydrofolate reductases，MTHFR)基因位点多态性成为女性不孕的研究热点[3-4]，而在男性不育中研究较少。MTHFR是叶酸代谢途径的关键酶，突变可造成体内嘌呤嘧啶合成异常及DNA、RNA甲基化异常，造成发育必须的DNA及蛋白质缺陷，因此可导致精子数量、活力、形态等异常，从而发生受精困难或质量低下受精卵形成[5-6]。本文旨在探讨MTHFR基因C677T和A1298C位点多态性与原发性男性不育的关系。

资料与方法

一、研究对象

选取2018年1～7月在台州市中心医院就诊的的原发性男性不育患者104例，年龄20～54岁；选取同期健康查体的已育男性108例为对照组，年龄19～44岁。

纳入标准[7]：(1) 原发性不育组为至少1年未避孕且从未使其配偶妊娠的男性，不育年限1～4年，每例均进行详细的病史采集和生殖专科检查，排除引起男性不育的其他因素，如隐睾、尿道下裂、精索静脉曲张、染色体异常、性腺发育不全等；女性配偶检查正常，排除其相关的不育因素，包括妇科检查、B超和子宫输卵管造影检查、女性生殖内分泌激素的检测；(2)正常生育对照组为男性生殖专科检查正常、并在近3年育有健康小孩的男性；(3)女性配偶年龄<36岁。所有研究对象均签署知情同意书。

二、方法

MTHFR基因多态性检测：采集不育组和对照组男性1～2 ml外周血，EDTA抗凝。用DNA提取试剂盒 (TIANamp Blood DNA Kit DP318，北京天根生化)提取DNA，应用ABI Stepone Plus实时荧光定量PCR仪(应用生物系统公司，美国)、MTHFR基因检测试剂盒(江西诺德)进行荧光定量PCR，检测MTHFRC677T和A1298C位点的基因多态性。引物系列见表1。PCR扩增程序：95℃总变性5 min，95℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环，72℃延伸10 min。

表1 MTHFR目的基因引物及扩增片段长度

三、统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。各等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

结 果

一、一般资料

参与本研究的104例患者年龄20～54岁，平均年龄(31.56±4.81)岁，为常住6年以上的台州居民，其中农民21%，工人36%，事业单位人员和公务员43%。所有患者均无隐睾、尿道下裂、精索静脉曲张、染色体异常、性腺发育不全等，所有患者常规体检均正常。对照组为健康查体的108例已育男性，年龄19～44岁，平均年龄(30.58±4.43)岁。

二、MTHFR基因C677T位点基因型频率及等位基因频率比较

原发性男性不育组CC、CT、TT型基因频率分别为34.62%、42.31%和23.08%，TT基因型在原发性男性不育组中分布频率显著升高，同时CC基因型在原发性男性不育组中表达频率显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。此外，T等位基因频率在原发性男性不育组中显著高于正常对照组(P<0.05)，相对于纯合未突变等位基因C 的相对危险度OR1.313[95%CI(1.029，1.674)](表2)。

三、MTHFR基因A1298C位点基因型频率及等位基因频率比较

男性不育组与正常对照组相比，其MTHFR基因A1298C位点基因型频率构成比均无显著性差异(P>0.05)；男性不育组的C等位基因频率与正常对照组相比无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表2 MTHFR基因C677T位点基因频率比较[n(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05

表3 MTHFR基因A1298C位点基因频率比较[n(%)]

讨 论

MTHFR是叶酸代谢途径的关键酶，MTHFRC677T 突变位点在第4 外显子 677位点上，一个胞嘧啶C变异成为一个胸腺嘧啶T，是目前发现的MTHFR基因最常见的不耐热错义突变，可导致酶活性降低。MTHFR基因另一常见多态性 A1298C在调节区的第7外显子上，A1298C 突变是由胞嘧啶C替代腺嘌呤A，不影响酶的催化活性，主要使酶的调节活性受影响[8]。

MTHFR基因突变可造成叶酸代谢障碍，体内嘌呤嘧啶合成异常及DNA、RNA甲基化异常，造成发育必须的DNA及蛋白质缺陷，在男性易引起精子缺陷。受精过程中，DNA缺陷的精子不易被卵母细胞的透明带自然识别，造成受精率低下。DNA损伤的精子进人卵子后，其染色质去致密化过程出现障碍，妨碍雄性原核的形成，可导致受精失败。在胚胎发育过程中，突变基因可使受精卵发育异常，从而导致受精卵着床不稳、胚胎发育异常、 胎儿畸形或胚胎发育停止、流产等。此外，MTHFR基因突变可导致体内具有细胞毒性的同型半胱氨酸(Hcy)水平增高，高Hcy血症代谢过程中，细胞内产生大量氧自由基，从而使精子核与线粒体DNA损伤，影响精子功能[9]。邹宇洁等[10]研究发现，MTHFR基因C677T位点多态性可影响精子活力、存活率、DNA完整性及顶体完整性，从而使精子质量下降，导致原发性男性不育的发生。

本研究显示，台州地区MTHFR基因C677T位点基因型与等位基因分布与原发性男性不育相关(χ2=6.975，P<0.05)。MTHFR基因C677T位点T等位基因在原发性男性不育组中分布频率显著高于对照组，T等位基因是原发性男性不育的危险因素[OR1.313，95%CI(1.029，1.674)]。MTHFR基因A1298C位点基因型与原发性男性不育无相关性(χ2=0.108，P>0.05)。这与Mfady等[11]研究的约旦人MTHFR基因C677T位点与男性不育有显著相关、A1298C位点基因型与男性不育无显著相关，Wu等[12]研究的亚洲人C677T突变易发生男性不育而A1298C位点则无明显影响相一致；与胡斐等[13]研究的C677T 多态性可能与男性少弱精子症的发生相关相似；但与周生辉等[14]、马芳芳等[15]研究的MTHFR基因C677T多态性与男性不育无显著相关不同。另一些研究报告也显示各种基因型在不育男性和对照组的分布并无差异，认为C677T与男性不育无关[16-17]。这可能与MTHFR基因位点多态性存在一定的地域差异有关。本文研究对象为常住6年以上的台州地区部分原发性不育男性，具有一定的地域局限性，代表性欠佳，因而MTHFR基因型及等位基因频率结果可能存在一定的偏差。今后将进行大样本量研究，使数据更接近真实情况。

通过本研究显示，检测育龄男性MTHFR基因位点多态性，与检测育龄女性MTHFR基因位点多态性同样具有意义。可根据基因结果进行个体化叶酸补充指导，改善精子结构和功能，减少原发性男性不育的发生。