评估精子浓度常用仪器准确性评价方法研究

王晓尉，谷翊群，周芳，梁小薇，许剑锋，卢文红

(国家卫生健康委科学技术研究所，北京 100081)

精液参数是诊断男性疾病、以及治疗效果评价的重要指标之一，同时也对评估男性生育力有着重要作用。多年来，精液参数评估方法多、技术要求高，操作很难标准化。因此，各个男科实验室以及相关机构都对自己的人员进行实验室操作的内部质量控制，以保证实验人员操作技术规范、检验结果的一致性和准确性。

虽然，各个实验室对于人员操作技术的规范相当重视，但却经常忽略相关实验仪器准确性的校准。误差的来源并不完全来自于操作者本身，仪器的误差也是检测结果误差的来源之一，尤其是现在各大三甲医院几乎都在使用计算机辅助精子分析系统(CASA)，对于仪器的准确性判断更是势在必行。

精子浓度一直是精液常规检测中问题比较大的一个指标。Makler计数板和CASA是实验室最常用的两个计数精子的仪器，但是经过长期使用的Makler计数板，其腔室容积会发生变化，CASA对于精子的捕捉是否准确，这些都是我们在实验中无法预知的，并且这些因素都有可能对我们的实验结果产生影响。根据《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第五版手册相关质控方法的介绍，我们总结了一些评估方法，探讨这些方法能否评估仪器的准确性。

资料与方法

一、研究对象

精液样本：北京人类精子库20例新鲜志愿者精液样本。样本采集见文献[1]。所有志愿者签署知情同意书。

混合精液质控品：对收集的液化和粘稠度都正常的精液样本进行充分混匀后，分装成10支，每支500 μl，作为浓度的质控样本。

质控珠：QC-BeadsTM质控珠(Bioscreen，美国)。

二、研究方法

1.精子浓度计数要求：利用改良Neubauer计数板、Makler计数板进行人工分析，以及用CASA进行自动分析。其中利用改良Neubauer计数板计数精子遵循《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第五版(以下简称“第五版”手册)的要求进行，Makler计数板和CASA计数则遵循仪器使用规范的要求进行计数，CASA计数时所用的载体为自带的10 μl深计数池。具体实验操作的技术员必须经过第五版手册相关技术的培训，并能够熟练使用改良Neubauer计数板、Makler计数板以及CASA对精子进行计数。

2.混合精液质控品评估：分别用改良Neubauer计数板、全新购置的Makler计数板(简称“新Makler计数板”)和使用超过7年的Makler计数板(简称“旧Makler计数板”)进行评估，将改良Neubauer计数板评估的精子浓度值作为标准，分别和新旧Makler计数板所及结果进行比较。

3.质控珠评估：利用新Makler计数板和旧Makler计数板分别对高(53～67×106/ml)、低浓度(25～34×106/ml)质控珠样本分别进行评估，评估得到的结果与质控珠给定的靶值范围绘制Youden图[2]，并对新、旧Makler计数板评估结果进行对比。

4.多份新鲜精液样本评估：利用改良Neubauer计数板、Makler计数板以及CASA对20份新鲜精液样本的浓度进行评估，将改良Neubauer计数板评估的浓度值作为标准，所得到的结果绘制Bland-Altman图[3-4]。

5.评估准确性控制：进行混合精液样本和质控珠的评估时，为了减少人为因素引入的误差，每次检测都要进行两次计数，并进行差异的一致性检验。对每个样本要进行多次(不少于10次)的检测。多份新鲜精液样本的评估[1]，每份样本检测都要进行两次计数，并进行差异一致性检验。

三、统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理。利用单因素方差分析、Youden图、Bland-Altman图以及配对t检验对新旧Makler计数板以及CASA检测的浓度结果进行分析，并检测差异性结果。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同计数板对混合精液质控品的计数结果

统计结果显示，不同计数板对同一份混合精液质控品的浓度连续检测结果变异系数(CV)均小于10%；与旧Makler计数板相比，新Makler计数板(P=0.006)和改良Neubauer计数板(P=0.03)均有显著性差异，而改良Neubauer计数板与新Makler计数板没有显著性差异(P=1.0)(表1)。

表1 不同计数板对同一份混合精液质控品连续进行10次评估结果(×106/ml)和单因素方差分析结果

注：与旧Makler计数板相比，*P<0.05

二、质控珠计数结果

统计结果显示，浓度连续浓度计数结果变异系数(CV)均小于10%，不论是高浓度(P=0.002 5)还是低浓度(P=0.009)，新、旧两个计数板所评估的结果都有显著性差异(表2)。根据质控珠给定的靶值范围，绘制Youden图，可以看出有部分点偏出了靶值范围，但是，所有点的分布相对比较集中，散点偏离靶值范围的距离并不远(图2)。

表2 不同计数板对同一份质控珠样本连续进行10次评估结果(×106/ml)和单因素方差分析

注：与同浓度新Makler计数板相比，*P<0.05

图1 显微镜下改良Neubauer计数板计数质控珠

●圆点代表新Makler计数板评估结果；▲三角代表旧Makler计数板评估结果图2 新、旧Makler计数板评估质控珠结果的Youden图

三、20份新鲜精液样本评估结果

A：改良绘制方法；B：传统绘制方法图3 改良Neubauer计数板vs. 旧Makler计数板的精子浓度计数Bland-Altman图

A：改良绘制方法；B：传统绘制方法图4 改良Neubauer计数板vs. CASA精子浓度计数的Bland-Altman图

对20份新鲜精液样本计数进行配对t检验，结果显示与改良Neubauer计数板相比，旧Makler计数板没有显著性差异(P>0.05)，CASA有显著性差异(P<0.05)(表3)。验证了Bland-Altman图改进方法判断的准确性。

表3 改良Neubauer计数板、旧Makler计数板和CASA对20份样本检测结果(×106/ml)

注：与改良Neubauer计数板相比，*P<0.05

讨 论

文中实验均依据第五版手册要求进行操作，其中改良Neubauer计数板评估浓度按照第五版计数方法要求完成，Makler计数板和CASA则按照相关规则进行计数，但也要按照手册要求每次或每个样本至少计数两次，并进行一致性分析。

通常男科实验室进行校准设备所用的质控样本有两种，一个是质控珠，另一个是自制的精液质控品。对于两种质控品对设备准确性评估效果，我们在实验中做了对比。为保证实验准确性，我们每个浓度都进行重复10次检测，以减少实验人员操作所带来的误差。在用自制的混合精液质控品中，以改良Neubauer计数板评估结果作为标准，评估结果进行One-way ANOVA进行分析 (表1)。而质控珠结果也同样方法进行计数(表 2)，但我们并没有对比改良Neubauer计数板的结果。首先，质控珠直径较小，在计数板内长时间不沉降(图1)，导致无法准确计数。其次，质控珠本身给定了靶值范围，没必要再用改良Neubauer计数板计算质控区间。从实验结果上看，无论是使用质控珠还是自制精液质控品，新、旧Makler计数板计数结果对比都有显著差异。而用自制精液质控品，新Makler计数板与改良Neubauer计数板计数浓度结果却没有显著差异。陆金春等[17]学者发现在精子浓度分析中，精子计数池的深度非常关键，使用不合格的计数板，将导致检测结果产生误差，这种误差和计数板深度误差成正比。因此我们推断，Makler计数板长期使用其准确度是有一定变化的。

实验中我们还发现，由于质控珠给定的靶值范围偏大，虽然旧Makler计数板计数浓度结果有部分不在靶值范围内，但新、旧计数板计数结果在Youden图(图2)中的点却很集中，并且超出靶值范围并不远，从图中我们并不能明显看出两块计数板计数结果的差异，但是从统计结果上看(表2)却有显著性差异。因此，我们更推荐男科实验室用自制的混合精液质控品进行Makler计数板的质控。自制质控品成本很低，而且容易获得，可以利用改良Neubauer计数板做靶值范围进行质控，但是在使用过程中要注意分装和取样时精液要混匀。若需要用质控珠进行评估，必须配合相应的统计学分析，而不能直接使用给定靶值范围。

Bland-Altman方法是一种介于定量和定性之间的方法，它可以用于判断两种方法或两个人测量结果的一致性。WHO第五版手册里推荐用此种方法分析和报告2名技术员之间的差异。这种方法最大的好处就是采用图示的方法，很直观的显示出判断结果。但是，很多人都忽略了Bland-Altman方法是有适用条件的[5]。对于传统的绘制方法，首先，差值的平均趋势在测量范围内保持不变，表现为图中散点分布与X轴平行；第二，差值的散布程度在测量范围内保持一致，表现为图中的散点分布在同宽的离散带内，即方差齐同；第三，差值的分布呈正态分布[6]。只有满足这三个条件，我们才能认为数据是良好的。否则直接使用Bland-Altman方法，不但得不到我们想要的真实结果，反而浪费了大量的数据[7，12]。

从上述实验结果显示，对于Bland-Altman方法改进是有一定效果的，但是前提是确保我们改进后的方法也要满足Bland-Altman方法的使用条件，该方法的使用要灵活、要符合本行业的实际情况[13-16]，切不可生搬硬套。

Makler计数板作为男科实验室常用的手工计数工具，很少有人关注其腔室深度的变化对精子计数结果的影响，而国内只有陆金春等[17]少数学者用Geoffrey精子计数池证明了二者的相关性。但是，实验只用了质控珠，而没有用精液样本，因此，其结果有一定的局限性。我们用两种质控品进行了对比，用实验数据更全面的阐述了哪种质控品更适合男科实验室。CASA对比手工实验的结果，国内做的很多[18-20]，大多数用统计学软件进行分析得到结果，虽然结果有说服力，但是不够直观，也无法显示更多细节，例如，有多少组数据偏差比较大，CASA在哪个浓度范围内测量比较准确等数据。Bland-Altman图在治疗方法和试剂盒检测结果对比方面应用非常广泛[13]，但是，在男科领域目前国内很少引用这种方法，卢文红等[2]将这种方法引入男科实验室人员质控，而利用这种方法对仪器进行质控和校准的，国内目前还是空白，我们希望通过这些方法能够为广大的男科实验室人员对相应的仪器质控和校准提供方法上的借鉴。