采前CaSO4处理对甘蓝芽苗菜采后品质的影响

唐 娟 许可心 朱英莲 刘 璇 郭丽萍

（青岛农业大学食品科学与工程学院 山东青岛266109）

十字花科芽苗菜，如西兰花芽苗、萝卜芽苗、甘蓝芽苗等因为含有丰富的营养物质和活性成分，在欧美、日本等国家已经成为一种新兴的具有保健功能的食品[1-3]。 甘蓝是我国食用频率较高的蔬菜之一，营养价值较高，含有丰富的维生素B1、维生素B2、类胡萝卜素和钙、铁等矿物质及膳食纤维。此外，还含有丰富的活性成分，如酚类物质、抗坏血酸、花色苷和硫代葡萄糖苷（简称硫苷）等[4-5]。 硫苷是十字花科植物中特有的一类含硫的次生代谢产物， 在黑芥子酶的作用下生成的产物之一异硫氰酸酯具有显著的抗癌、抗炎、抑菌、预防心脑血管疾病等生理活性[6]。

研究表明，甘蓝中硫苷含量显著高于白菜、芥菜和萝卜[7]。 甘蓝的价格低于西兰花；甘蓝种子是开发芽苗菜的良好原料。芽苗菜采后迅速老化，货架期较短，制约了其工业化生产[8]。 目前对于芽苗菜采后生理生化变化及保鲜方面的研究相对较少。钙离子在植物生长中起着重要的作用，可以激活植物体内的酶类，提高膜稳定性。 研究发现，钙处理可以延缓水果和蔬菜贮藏过程中的果实的成熟和叶片的衰老，保持细胞膜的完整性[9]。 Kou 等[8]通过采前CaCl2处理提高了西兰花芽苗菜的生物量和抗氧化酶活性，延缓西兰花芽苗菜的衰老，并保护细胞壁完整性，从而延长其货架期。 CaSO4作为一种含硫的化合物是否有利于甘蓝芽苗菜中硫苷的合成，以及是否能够延缓其衰老，提高甘蓝芽苗菜的质量尚未见报道。

本文通过外源喷施CaSO4处理， 研究了甘蓝芽苗菜在贮藏过程中抗坏血酸、总酚、抗氧化酶活性、硫苷、异硫氰酸酯和黑芥子酶活性的变化，旨在推动甘蓝芽苗菜的工业化生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘蓝种子：购于寿光市城区蔬菜种子公司。

Sinigrin 标准品、萝卜硫素标准品、硫酸酯酶、抗坏血酸，美国Sigma 公司；DEAE Sephadex TMA-25 离子交换树脂、咪唑，北京索莱宝科技有限公司；二氯甲烷、没食子酸、Folin-酚、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝、没食子酸，国药集团上海化学试剂有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯），上海陆都化学试剂厂；葡萄糖测定试剂盒、T-AOC 试剂盒、T-SOD 测定试剂盒，南京建成生物工程公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200 液相色谱仪， 美国安捷伦公司；TDL-40B 离心机， 上海安亭科学仪器厂；WFL UV-2000 紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司； Anke TDL-5 飞鸽牌离心机，上海安亭科学仪器厂；AE100 电子秤，上海天达仪器有限公司；PHS-3C 精密pH 计，上海雷磁仪器厂；光照培养箱， 上海高致精密仪器有限公司；DK-S24 型电热恒温水浴锅，龙口市尼科仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘蓝芽苗菜的处理 将甘蓝种子消毒后，于30 ℃浸泡4 h， 然后将种子均匀撒至铺有蛭石的育苗盘中， 将其置于16 h 光照/8 h 黑暗循环的培养箱中于25 ℃下培养， 每8 h 喷蒸馏水1 次，1 d 后进行处理； 根据前期试验结果，CaSO4的浓度为10 mmol/L，每天喷施2 次，对照喷施蒸馏水，播种9 d 后收获，去根，将其分别用保鲜膜包裹后于4 ℃冰箱贮藏，分别于0，5，10 和15 d 取样进行分析。

1.3.2 电解质渗透率的测定 根据Dionisio-Sese等[10]的方法略加修改。 称取0.5 g 芽苗叶、茎分离，茎切成3 mm 的长度，叶和茎一起浸入30 mL 去离子水中， 于25 ℃振荡1 h 后， 测定电导率记为EC1，然后在沸水中煮10 min，以杀死植物组织，冷却后调整体积为30 mL， 测定煮沸电导率记为EC2。

电解质渗透率（%）=（EC1/EC2）×100

1.3.3 抗坏血酸的测定 采用王志英等[5]的方法进行测定，结果以mg/100 g 鲜重表示。

1.3.4 总酚含量的测定 根据参考文献[11]，取0.4 g 芽苗， 用50%甲醇研磨匀浆后10 000 g 离心，取1 mL 上清液，加入1 mL 0.2 mol/L 福林酚试剂和2 mL 2% Na2CO3溶液， 避光反应2 h 后，于765 nm 处测定吸光值。 用没食子酸作标准曲线，计算总酚含量。

1.3.5 总抗氧化能力的测定 总抗氧化能力用南京建成生物工程公司的T-AOC 试剂盒进行测定。

1.3.6 抗氧化酶活性的测定 抗氧化酶的提取参照de Azevedo 等[12]的方法稍作修改。 称取样品0.50 g， 用5 mL 预冷的50 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0， 含0.1 mmol/L EDTA，1%聚乙烯吡咯烷酮）冰浴研磨匀浆，于16 000 g 冷冻离心20 min，上清液即为粗酶液。 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）根据T-SOD 测定试剂盒进行，酶活性单位 （U）记为1 mg 蛋白在1 mL 反应液中SOD 抑制率达50%时所对应的SOD 量。过氧化氢酶（catalase，CAT）活性的测定根据de Azevedo等[12]的方法，以反应液每分钟在240 nm 波长处吸光值变化0.001 为1 个酶活力单位。 过氧化物酶（peroxidase，POD）采用愈创木酚法[13]测定，以1 mg 组织蛋白1 min 内在470 nm 处的吸光度降低0.01 为1 个酶活单位（U）。

1.3.7 硫苷含量的测定 根据王志英等[5]的方法进行， 甘蓝芽苗菜经灭酶提取后， 经DEAE SephadexTM A-25 离子交换柱进行分离， 加入200 μL 硫酸酯酶脱硫处理后，用HPLC 进行分析，以苯甲基硫苷作为内标。

1.3.8 异硫氰酸酯的测定 参考赵功玲等[14]的方法略加修改。取0.5 g 样品，加入4 mL 水研磨至匀浆，于37 ℃下水解3 h 以彻底释放异硫氰酸酯，然后加入3 mL 二氯甲烷萃取30 min，10 000 g 离心15 min。 取二氯甲烷层200 μL，依次加入2 mL 甲醇，1.8 mL pH 8.5 的硼砂缓冲液，200 μL 1，2-苯二硫醇8 nmol/L 的1，2-苯二硫醇的甲醇溶液，于65 ℃水浴反应1 h 后在365 nm 处测定吸光值。 用萝卜硫素作标准曲线， 根据标准曲线计算出样品异硫氰酸酯生成量。

1.3.9 黑芥子酶活性的测定 根据参考文献[11]的方法进行测定。 以每分钟被黑芥子酶转化生成1 nmol 葡萄糖为1 个酶活力单位， 酶活单位为U/mg protein。

1.4 数据统计与分析

试验设3 次重复，各指标重复测定3 次，结果以平均值（means）± 标准偏差（SD）表示。 数据采用统计分析软件18.0 （SPSS， 18.0）进行统计分析，均值间比较采用Duncan’s 多重比较，设置显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中电解质渗透率的影响

由图1 可以看出， 在贮藏过程中甘蓝芽苗菜的电解质渗透液逐渐增加，CaSO4处理下的芽苗菜中电解质渗透液显著低于对照。 在新鲜的芽苗菜中，电解质渗透液无显著差异，贮藏15 d 后，CaSO4处理下芽苗菜中电解质渗透液较对照低33.9%。

2.2 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中抗坏血酸和总酚含量的影响

甘蓝芽苗菜中抗坏血酸含量在贮藏过程中不断下降，CaSO4处理显著延缓了抗坏血酸含量的降低（图2a）；贮藏15 d 后，对照和CaSO4处理下的芽苗中抗坏血酸含量较初始分别降低了67.0%和45.2%。 但是，甘蓝芽苗菜中总酚含量在贮藏过程中却不断增加（图2b），在新鲜的芽苗中，CaSO4处理组低于对照；而贮藏15 d 后，CaSO4处理下的芽苗中抗坏血酸含量较对照组高23.5%。

图1 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中电解质渗透率的影响Fig.1 The effect of CaSO4 treatment on electrolyte leakage of cabbage sprouts during storage

图2 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中抗坏血酸（a）和总酚（b）含量的影响Fig.2 The effect of CaSO4 treatment on the contents of ascorbic acid and total phenoics in cabbage sprouts during storage

2.3 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中抗氧化酶活性的影响

采前CaSO4处理显著提高了甘蓝芽苗菜的抗氧化酶活性。 其中，随着贮藏时间的推移，SOD 活性不断下降，CaSO4处理较对照提高了芽苗的SOD 活性； 在0 和15 d，CaSO4处理的芽苗菜中SOD 活性分别是对照的1.21 倍和3.09 倍。对照组芽苗中POD 活性在贮藏过程中呈增强趋势，而CaSO4处理的芽苗菜中POD 活性在整个贮藏期间无显著变化， 无论新鲜的芽苗还是贮藏过程中，CaSO4处理下芽苗菜的POD 活性均显著高于对照。 在贮藏过程中，对照组芽苗的CAT 活性逐渐下降， 而CaSO4处理组的CAT 活性无显著变化，贮藏15 d 后，CaSO4处理的芽苗中CAT 活性是对照的1.95 倍。

2.4 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中硫苷含量的影响

如图4 所示， 在甘蓝芽苗菜中共检测到7 种硫苷， 其中4 种脂肪硫苷 （GIB、PRO、SIN 和GNA），2 种吲哚族硫苷（4HGB 和GB）和1 种芳香族硫苷（GNT）；含量最多的硫苷为3-甲基亚磺酰基丙基硫苷（GIB），2-丙烯基硫苷（SIN）次之。 除PRO 和GB 外， 新鲜芽苗菜中其它硫苷经CaSO4处理后均显著提高。在贮藏过程中，芽苗菜中总硫苷和每种硫苷含量均显著下降，CaSO4处理阻碍了其下降速度。 贮藏15 d 后，对照和CaSO4处理下的芽苗菜中GIB 分别下降了78.4%和53.8%、SIN 下降了76.1%和65.8%， 总硫苷分别下降了76.5%和61.2%。

图3 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中抗氧化酶活性的影响Fig.3 The effect of CaSO4 treatment on the activity of antioxidant enzyme in cabbage sprouts during storage

图4 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中硫苷含量的影响Fig.4 The effect of CaSO4 treatment on glucosinolate content in cabbage sprouts during storage

2.5 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中黑芥子酶活性的影响

图5 结果表明， 在贮藏过程中甘蓝芽苗菜中黑芥子酶活性不断降低，CaSO4处理显著减慢了其降低速度； 新鲜芽苗中黑芥子酶活性在对照和CaSO4处理下无显著差异，贮藏15 d 后，CaSO4处理下黑芥子酶活性较对照高74.4%。

2.6 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中异硫氰酸酯含量的影响

从图6 可以看出， 甘蓝芽苗中异硫氰酸酯含量在贮藏过程中不断下降，CaSO4处理提高了新鲜甘蓝芽苗中异硫氰酸酯含量， 并阻碍了贮藏过程中其含量的下降速度。 贮藏15 d 后， 对照和CaSO4处理下芽苗中异硫氰酸酯含量分别较新鲜芽苗降低66.9%和40.9%。

图5 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中黑芥子酶的影响Fig.5 The effect of CaSO4 treatment on myrosinase activity in cabbage sprouts during storage

图6 CaSO4 处理对甘蓝芽苗菜贮藏过程中异硫氰酸酯含量的影响Fig.6 The effect of CaSO4 treatment on isothiocyanate content in cabbage sprouts during storage

3 讨论

甘蓝芽苗菜具有较高的营养价值和保健功能，虽然在我国还鲜见食用，但已引起研究者的重视。 但是其货架期较短，因此难以大量生产，影响其开发利用。 钙对植物的生长发育有重要的调节作用，并能活化某些酶类，提高膜稳定性。 电解质渗透率是表示细胞膜损伤的主要指标之一， 能够反映细胞的完整性[15]。 KOU 等[8]研究发现，外源CaCl2处理后，西兰花芽苗菜的电解质渗透率显著降低。 本研究中，CaSO4处理甘蓝芽苗菜也得到了相似的结果，表明这主要是Ca2+所起的作用。 抗坏血酸和酚类物质是重要的抗氧化成分， 能够清除过量的自由基。 本研究中甘蓝芽苗中抗坏血酸含量在贮藏过程中不断降低，这与胡花丽等[16]在猕猴桃贮藏过程中的研究结果一致； 原因是与抗坏血酸-谷胱甘肽循环过程中的抗坏血酸过氧化物酶、脱氢抗坏血酸还原酶、单脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶的增加有关。 汤月昌等[17]发现，西兰花在贮藏过程中总酚含量不断增加， 这与甘蓝芽苗菜中的研究结果一致。 采前CaSO4处理降低了甘蓝芽苗中总酚含量， 在贮藏的前10 d 与对照无显著差异， 而贮藏15 d 后CaSO4处理的芽苗中总酚含量显著高于对照； 这可能与苯丙氨酸解氨酶的活性有关， 因为苯丙氨酸解氨酶是酚类物质合成过程中的重要酶[17]。

蔬菜和水果采后衰老源于活性氧的积累，由于活性氧产生和清除之间的平衡被破坏， 使其衰老加剧。 SOD、POD 和CAT 是植物体内重要的抗氧化酶，能够清除活性氧，防止果实的衰老。 贮藏过程中， 西兰花芽苗菜的SOD 活性不断下降，而POD 活性逐渐增强[8]，这与本研究结果一致；但是CAT 活性在西兰花芽苗菜中逐渐增强， 在本研究中却呈现下降趋势。 汤月昌等[17]研究表明，在西兰花衰老过程中，CAT 活性呈现上升趋势。而田平平等[18]在杏鲍菇的研究中发现，CAT 活性呈现先下降再上升再下降的趋势。因此，CAT 活性在果蔬贮藏中的变化与果蔬种类有很大关系， 具体原因还有待于进一步研究。KOU 等[8]研究表明，采前CaCl2处理显著提高了西兰花芽苗的SOD、POD 和CAT活性； 本研究中，CaSO4处理也显著提高了甘蓝芽苗中SOD、POD 和CAT 的活性， 表明Ca2+可以提高植物中抗氧化酶的活性。

硫苷作为十字花科植物中特有的一类含硫物质， 在植物防御和抵抗胁迫过程中起重要作用[4]。众多研究者试图通过施加硫肥提高植物的硫苷含量，Pérez-Balibrea 等[19]研究发现，15，30，60 mg/L的K2SO4提高了9 d 和12 d 西兰花芽苗中硫苷的含量。 Yang 等[20]研究表明，ZnSO4提高了新鲜西兰花芽苗中硫苷含量，但是降低了其生物量。 Sun等[21]发现CaCl2也提高了新鲜西兰花中硫苷含量。而CaSO4兼具硫肥和钙的双重作用， 显著提高了新鲜甘蓝芽苗中硫苷含量， 具体机理还需要进一步研究。 西兰花芽苗在贮藏过程中，硫苷含量不断下降，并抑制了贮藏过程中硫苷含量的降低[21]。 本研究中CaSO4也显著延缓了各种硫苷含量的降低速度。 异硫氰酸酯是脂肪族硫苷和芳香族硫苷在黑芥子酶的作用下形成的产物之一， 具有显著的抗癌作用，因此引起了国内外的广泛关注。 在本文的甘蓝芽苗菜中， 能形成异硫氰酸酯的硫苷有GIB、SIN、GNA 和GNT， 虽然PRO 也是脂肪族硫苷， 但其产物是人体有害的5-乙烯噁唑烷-2-硫酮[5]。在甘蓝芽苗菜贮藏过程中，CaSO4处理下甘蓝芽苗菜中异硫氰酸酯含量显著高于对照， 这是由于其前体物质（GIB、SIN、GNA 和GNT）含量的增加和黑芥子酶活性的增强所致。

4 结论

采前CaSO4处理降低了甘蓝芽苗菜的电解质渗透液， 保护了其细胞膜的完整性； 在贮藏过程中，甘蓝芽苗菜中抗坏血酸含量逐渐下降，而总酚含量逐渐增加；CaSO4处理显著抑制了甘蓝芽苗菜中抗坏血酸含量的降低，提高了总酚含量。 同时，CaSO4处理显著提高了抗氧化酶SOD、POD 和CAT 的活性。

CaSO4处理显著提高了新鲜甘蓝芽苗菜中GIB、GNT、4HGB、SIN 和GNA 5 种硫苷的含量，同时抑制了所有硫苷在贮藏过程中的降低速度；黑芥子酶活性和异硫氰酸酯含量经CaSO4处理后也显著增加。 这些结果表明，采前CaSO4处理可以提高甘蓝芽苗菜的质量，有效延缓其衰老，延长货架期， 对甘蓝芽苗菜的开发和利用具有非常重要的现实意义。