杜鹃素通过增强Kv1.5和Kv2.1表达抑制尼古丁所致的肺动脉平滑肌细胞增殖*

侯晓敏， 张明升， 秦小江△

(山西医科大学 1基础医学院, 2公共卫生学院， 山西 太原 030001)

吸烟是心血管和肺部疾病发展的风险因素之一[1]，其对人体健康的影响已逐渐受到公众的普遍重视。尼古丁(nicotine)作为香烟烟雾的组成部分，约占烟草生物碱总量的95%[2]，能够对机体产生广泛的影响，如影响心血管系统，通过影响肾素-血管紧张素系统[1]升高肺动脉压力，进而促进肺动脉高压发生[3]等。杜鹃素(farrerol,Far)作为一种天然黄酮类化合物，可以对心血管产生保护作用。研究报道，杜鹃素能够通过降低缝隙连接蛋白43的表达抑制血管紧张素Ⅱ所诱导的血管平滑肌细胞增殖[4]，体外实验中杜鹃素可降低主动脉血管张力[5]，此外，杜鹃素还可以通过调整大鼠的基因表达谱改善自发性高血压大鼠的血管损伤[6]。心血管疾病在很多情况下表现为血管平滑肌细胞增殖，本实验通过使用尼古丁诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)增殖,观察不同浓度杜鹃素对尼古丁所致PASMCs增殖的作用，并进一步探讨杜鹃素的作用与电压依赖性钾通道(voltage-de-pendent potassium channels，Kv)1.5和Kv2.1的关系。

材 料 和 方 法

1 主要材料和试剂

杜鹃素(纯度≥98%)：由山西医科大学药学院药物化学实验室合成提供。细胞裂解液购自碧云天生物技术研究所。凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。抗Kv1.5、Kv2.1及Bax和Bcl-2多克隆抗体及HRP标记的Ⅱ抗：购自上海生工公司，优级胎牛血清购自Scicell；DMEM/F12培养液购自武汉博士德公司；尼古丁购自北京伊普瑞斯公司。

2 方法

2.1大鼠PASMCs的培养 参照文献分离得到大鼠PASMCs[7-9]。大鼠(腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg)麻醉后，取出其肺脏，显微镜下分离得到其肺动脉。镜下将肺动脉纵向切开，用无菌棉签刮去其内膜，然后用镊子剥去其动脉外膜。用眼科剪将剩余肺动脉剪碎，使其呈现大约1 cm×1 cm×1 cm大小。然后加入含20%胎牛血清的DMEM低糖培养液，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

2.2不同浓度尼古丁对PASMCs细胞计数的影响

将PASMCs接种于24孔板(每孔5×103个细胞)培养过夜。然后换液在无血清培养液中持续培养24 h，随后将不同浓度(0.01，0.1，1和10 μmol/L)尼古丁加入细胞培养液中对PASMCs进行24 h培养，在培养结束时，收集PASMCs并进行细胞计数[10]。实验重复6次。

2.3大鼠PASMCs的分组培养 将PASMCs随机分成5组进行培养：正常对照(control)组，使用正常细胞培养液对PASMCs进行培养；尼古丁(nicotine)组，使用含有1 μmol/L尼古丁的培养液对PASMCs进行培养；尼古丁(1 μmol/L)+低浓度(10-6mol/L)中浓度(10-5mol/L)高浓度(10-4mol/L)Far组，分别使用同时含有1 μmol/L尼古丁和10-6、10-5或10-4mol/L杜鹃素的培养液对PASMCs进行培养。

2.4Caspase-3活性检测 将PASMCs种植于6孔板，每孔5×104个细胞，按照方法2.3的描述分组干预48 h后, 1×PBS清洗PASMCs 2次，RIPA裂解收集细胞，按照caspase-3活性细胞凋亡检测试剂盒说明书依次进行相关指标的检测[11]。实验重复3次。

2.5CCK-8法检测细胞活力 将PASMCs种植于96孔板，每孔5×103个细胞，按照方法2.3的描述分组干预48 h后，换成正常培养液，给每个孔中都加入CCK-8(10 μL)和新鲜培养液，然后放置于孵箱中(5% CO2、37℃)进行培养2 h，使用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(A)值[11]。

2.6流式细胞术检测细胞凋亡率 取各组对数生长期的细胞，制成单细胞悬液，调整待测细胞浓度为1×109/L。按照2.3的描述分组干预24 h后，按照试剂盒说明，取1 mL细胞300 ×g、4℃离心10 min，弃上清。然后将细胞悬于200 μL Binding Buffer，加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室温下避光标记10 min，1 h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡[12-13]。

2.7RT-qPCR检测凋亡相关因子Bax和Bcl-2及Kv1.5和Kv2.1的mRNA表达 提取各组PASMCs总的RNA之后，参照文献[9]严格依照RT-qPCR操作流程，检测各组Kv1.5、Kv2.1、Bax和Bcl-2 mRNA相对表达量，每组实验重复3次。引物委托上海生工合成，内参照为GAPDH。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.8Western blot检测凋亡相关因子Bax和Bcl-2及Kv1.5和Kv2.1的蛋白表达

提取各组细胞总蛋白后，依据BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书对蛋白浓度进行测定。然后依照Western blot操作步骤，检测各组Kv1.5、Kv2.1、Bax和Bcl-2蛋白的表达，每组实验重复3次。Ⅰ抗 Kv1.5、Kv2.1、Bax和Bcl-2多克隆抗体的稀释度均为 1 ∶500 ，HRP标记的Ⅱ抗稀释度均为 1 ∶1 000。内参照为β-actin。

3 统计学处理

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，应用 SPSS 13.0统计软件分析，采用方差分析进行多组间比较，LSD检验进行两两比较，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 细胞计数法检测尼古丁对大鼠PASMCs增殖的影响

与空白对照组比较，0.1～10 μmol/L的尼古丁可显著增加PASMCs的细胞计数，其中1 μmol/L尼古丁效应最强(P<0.01)，见图1。因此，我们后续实验中，尼古丁的浓度均为1 μmol/L。

Figure 1.Effects of nicotine on the proliferation of rat PASMCs were evaluated by cell counting. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1 利用细胞计数法检测大鼠肺动脉平滑肌细胞数量

2 尼古丁对大鼠PASMCs中caspase-3活性的影响及杜鹃素的作用

与对照组相比，尼古丁处理大鼠PASMCs 48 h后，细胞caspase-3活性显著降低(P<0.01)，表明细胞凋亡被明显抑制。10-6mol/L～10-4mol/L杜鹃素可以逐渐逆转尼古丁所造成的caspase-3活性降低，10-4mol/L杜鹃素可以达到最为显著的效果(P<0.01)，见图 2。

Figure 2.The caspase-3 activity of rat PASMCs was detected. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsnicotine group.

图2 大鼠肺动脉平滑肌细胞caspase-3活性检测

3 尼古丁对大鼠PASMCs细胞活性的影响及杜鹃素的作用

与对照组相比，使用尼古丁孵育大鼠肺动脉血管平滑肌细胞48 h后，细胞活力显著增加(P<0.01)，10-6mol/L～10-4mol/L杜鹃素可以逐渐地逆转尼古丁所造成的细胞活力增加，10-4mol/L杜鹃素可以达到最大干预效果(P<0.01)，见图 3。

4 尼古丁对大鼠PASMCs凋亡的影响及杜鹃素的作用

与对照组相比较，尼古丁降低了PASMCs凋亡率(P<0.01)。与尼古丁组相比，10-5mol/L杜鹃素干预显著增加了PASMCs的凋亡率(P<0.01)，见图4。

5 尼古丁对PASMCs凋亡相关基因(bax和bcl-2)mRNA和蛋白表达的影响及杜鹃素的作用

与对照组相比，尼古丁刺激PASMCs 24 h后，其细胞的Bcl-2 mRNA和蛋白表达显著增多,Bax的mRNA和蛋白表达显著减弱。联合使用10-5mol/L杜鹃素可以部分逆转尼古丁的效果，差异具有显著性(P<0.01)，见图 5。

Figure 3.The activity of rat PASMCs was detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsnicotine group.

图3 CCK-8法检测大鼠肺动脉平滑肌细胞活力

Figure 4.Flow cytometric analysis for Annexin V-FITC and PI staining in PASMCs treated with nicotine (1 μmol/L) or nicotine combines with farrerol (10-5mol/L). Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsnicotine group.

图4 流式细胞术检测大鼠肺动脉血管平滑肌细胞凋亡

Figure 5.Effects of nicotine (1 μmol/L) and farrerol (10-5mol/L) on the expression of Bcl-2 and Bax mRNA (A and B) and protein (C and D) in rat PASMCs. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsnicotine group.

图5 检测大鼠肺动脉血管平滑肌细胞Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表达

6 尼古丁对PASMCs的Kv1.5和Kv2.1 mRNA和蛋白表达的影响及杜鹃素的作用

使用1 μmol/L尼古丁干预24 h可显著抑制PASMCs Kv1.5和Kv2.1的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。而联合使用10-5mol/L杜鹃素则可以部分逆转尼古丁的效果(P<0.01)，见图 6。

讨 论

杜鹃素是从中药满山红中提取得到的一种典型黄酮类化合物，已经被广泛用于支气管哮喘的治疗[14]。研究表明，杜鹃素拥有多种生物学效应，包括抗菌，抗炎和抑制细胞增殖[15]等。

Caspase-3属于caspase家族的成员之一，是哺乳动物细胞凋亡的关键酶[16]。Bcl-2家族包括一系列与凋亡相关的细胞因子，如Bax、Bak、Bcl-2和Bcl-xl等，其中Bax和Bak可以促进细胞凋亡，而Bcl-2和Bcl-xl则可抑制细胞凋亡。本实验通过检测caspase-3活性及Bcl-2和Bax的变化，可以部分反映PASMCs的增殖与凋亡情况。我们观察到, 1 μmol/L尼古丁能显著降低PASMCs的caspase-3活性，增强细胞活性；尼古丁可以抑制大鼠PASMCs 的Bax并增强Bcl-2表达。这些结果提示，尼古丁能够引起大鼠PASMCs发生异常增殖反应。而后续的实验证明杜鹃素可浓度依赖性地逆转尼古丁的作用。

Kv通道是动脉上表达比较丰富的钾离子通道[17]，抑制PASMCs中的Kv通道可导致膜去极化，开放细胞膜上的电压依赖性钙通道，进而通过促进Ca2+内流而诱导肺血管收缩。因此，Kv通道的抑制剂有助于通过增加[Ca2+]i刺激PASMCs增殖，还可以通过降低胞质内的caspase活性来抑制PASMCs凋亡。而如果Kv通道被激活，则能够起到抑制PASMCs增殖，促进其凋亡的作用[18]。体外研究显示，肺动脉高压大鼠PASMCs上的Kv1.5表达显著降低[3]，过表达Kv1.5可促进细胞凋亡，尼古丁可以抑制人类PASMCs的Kv1.5电流[19]。研究报道[3]，尼古丁刺激能够抑制大鼠PASMCs中Kv1.5和Kv2.1的mRNA 表达。本实验得出了与之相一致的结论，1 μmol/L尼古丁可显著抑制大鼠PASMCs的Kv1.5和Kv2.1表达，而10-5mol/L杜鹃度可显著逆转尼古丁的抑制效果。这些结果可以说明，杜鹃素能够通过增强PASMCs中Kv1.5和Kv2.1表达对尼古丁所致上述作用起到一定改善效果。

Figure 6.Effects of nicotine (1 μmol/L) and farrerol (10-5mol/L) on the expression of Kv1.5 and Kv2.1 mRNA (A and B) and protein (C and D) in rat PASMCs. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsnicotine group.

图6 检测大鼠肺动脉血管平滑肌细胞Kv1.5和Kv2.1的mRNA和蛋白表达

综上所述，杜鹃素能够通过促进Kv1.5和Kv2.1表达对抗尼古丁所引起的大鼠PASMCs增殖反应，这为临床使用杜鹃素作为预防和治疗肺动脉平滑肌细胞增殖性疾病提供了参考资料。