干旱胁迫对猪苓菌丝生长及多糖合成相关酶活性的影响

徐梦馨，郭宏波，廉 冬，马珍璐，张跃进，孙建华

(1. 西北农林科技大学 化学与药学院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨凌 712100；3.陕西汉王略阳中药科技有限公司，陕西略阳 724300)

猪苓[Polyporusumbellatus(Pers.) Fries]为多孔菌科药用真菌，别名猪屎苓、猪茯苓、野猪粪等，以干燥菌核入药，归肾、膀胱经，具有利水渗湿功效，临床常用于治疗小便不利、水肿、泄泻、淋浊和带下等症[1]。研究发现，猪苓中含有猪苓多糖、甾体等多种有效成分[2]，其中猪苓多糖可以提高机体免疫力，并通过抗氧化抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡，从而抑制肿瘤基因表达[3-8]。

随着猪苓多糖抗癌作用的发现以及中国医疗事业的发展,以猪苓为原料的成品药也不断开发,猪苓药材市场需求呈增加趋势，有关猪苓的研究及人工栽培备受关注[9]。然而，目前猪苓的生物学特性尚不完全清楚，人工半野生栽培需时较长、产量低。猪苓袋料培养及液体培养具有成本低、增殖快等优点，是猪苓药材今后发展的一个重要方向。本试验是在前期研究工作的基础上，研究不同干旱胁迫条件对猪苓液体培养中菌丝生长、多糖质量分数和多糖合成相关酶活性的影响，以揭示猪苓菌丝耐干旱胁迫程度及其与多糖合成之间的关系。为猪苓菌丝干旱胁迫适应机制及猪苓多糖合成代谢途径的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株为西北农林科技大学中药材规范栽培实验室保藏菌种，产地来源为陕西略阳，经西北农林科技大学舒志明副教授鉴定为多孔菌科猪苓(P.umbellatus)菌种。培养基为改良完全培养基，设置不同质量浓度(0、50、100、150、200、250 g/L)PEG-6000处理进行液体培养，将猪苓菌种接种后，在恒温摇床中25 ℃、150 r/min黑暗培养7 d，培养菌丝用于后续 试验。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 生物量测定 猪苓液体培养7 d后，过滤收集猪苓菌丝，于60 ℃烘箱中烘干至恒质量，进行称量，计算生物量。各处理随机取样，重复3次，下同。

1.2.2 多糖质量分数测定 取烘干至恒质量的猪苓菌丝，粉碎后过60目筛。称取0.10 g粉末，加入30倍蒸馏水，超声波提取，重复2次，合并滤液。以葡萄糖为对照，采用硫酸—蒽酮法绘制葡萄糖浓度/吸光度(X/Y)标准曲线，标准曲线为：Y=10.096X-0.030 9(R2=0.999 8)。取待测液测定吸光值，根据标准曲线计算各样品的多糖质量分数。

1.2.3 抗氧化酶活性测定 参照李合生[10]的方法测定新鲜猪苓菌丝各项生理指标，采用氮蓝四唑(NBT) 法测定超氧化物歧化酶(SOD) 活性，愈创木酚法测定过氧化物酶(POD) 活性，高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶(CAT)活性。

1.2.4 丙二醛(MDA)质量摩尔浓度测定 采用硫代巴比妥酸(TBA) 法测定新鲜猪苓菌丝中MDA质量摩尔浓度。

1.2.5 可溶性蛋白质量分数测定 采用考马斯亮蓝G-250法测定新鲜猪苓菌丝中可溶性蛋白的质量分数。

1.2.6 游离脯氨酸质量分数测定 采用磺基水杨酸法测定新鲜猪苓菌丝中游离脯氨酸的质量 分数。

1.2.7 多糖合成相关酶活性测定 取不同处理下的新鲜猪苓菌丝，准确称取0.50 g，加2.5 mL 预冷细胞提取缓冲溶液(20 mmol/L磷酸钾盐缓冲溶液，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2和1 mmol/LDTT，pH 6.5)，4 ℃，14 000 r/min离心15 min，取上清，获得酶液样品，待测。参照Schaffer等[11]的方法测定己糖激酶(HK)活性；参照Looijesteijn等[12]的方法测定α-磷酸葡萄糖变位酶(α-PGM)和磷酸葡萄糖异构酶(GPI)的活性。以不加酶液为空白对照，在340 nm处检测辅酶Ⅱ NADP(H)的变化，从加入酶液开始读数，以反应体系中每分钟增加或减少1 nmol的辅 酶Ⅱ NADP(H) 定义为1个酶活单位(U)。

1.3 数据处理及分析

采用SPSS 21.0和Excel 2003软件进行数据处理和方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度PEG-6000处理对猪苓菌丝生长的影响

2.1.1 菌丝生物量 不同质量浓度PEG-6000处理对液体培养猪苓菌丝生物量的影响较大，如图1所示。猪苓菌丝生物量随PEG-6000质量浓度升高呈先升高后降低的趋势，PEG-6000质量浓度为50～150 g/L，表现为促进作用，当PEG-6000质量浓度为100 g/L时，猪苓菌丝生物量最高，较对照组显著增加60.40%。当PEG-6000质量浓度为200 g/L时，猪苓菌丝生物量与对照组无显著差异。当PEG-6000质量浓度为250 g/L时，猪苓菌丝生长受到抑制。说明适度干旱胁迫有利于猪苓菌丝生长，随着干旱程度增大，猪苓菌丝生长受到一定威胁。

不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同 Different lowercase letters indicate the significant difference among different treatments(P<0. 05) . The same below．

图1 不同干旱胁迫条件下猪苓菌丝生物量
Fig.1 Biomass ofP.umbellatusmyceliumunder different drought stresses

2.1.2 菌丝中抗氧化酶活性 不同质量浓度PEG-6000处理对液体培养猪苓菌丝中POD活性的影响较大，如图2-A所示。当PEG-6000质量浓度为50～150 g/L时，猪苓菌丝中POD活性显著高于对照组。当PEG-6000质量浓度为150 g/L时，POD活性最高，并显著高于其他处理组。当PEG-6000质量浓度为50、100和150 g/L时，POD活性分别较对照组增加6.47倍、9.34倍和12.09倍。当PEG-6000质量浓度>150 g/L时，猪苓菌丝中POD活性显著降低，与对照组无显著差异。

不同质量浓度PEG-6000处理对液体培养猪苓菌丝中CAT活性的影响较大，如图2-B所示。CAT活性随PEG-6000质量浓度升高呈先降低后升高的趋势。对照组CAT活性显著高于各处理组。当PEG-6000质量浓度为100 g/L和150 g/L时，猪苓菌丝中CAT活性最低，且二者之间无显著差异，分别较对照组减少17.82%和 15.15%。当PEG-6000质量浓度>150 g/L时，CAT活性增强，但仍显著低于对照组。

不同质量浓度PEG-6000处理对液体培养猪苓菌丝中SOD活性的影响较大，如图2-C所示。SOD活性与POD活性变化一致，随PEG-6000质量浓度升高呈先升高后降低的趋势，当PEG-6000质量浓度为150 g/L时，猪苓菌丝中SOD活性最高，较对照组增加2.44倍。当PEG-6000质量浓度>150 g/L，SOD活性呈下降趋势，但在试验范围内显著高于对照组。

以上研究结果表明，PEG-6000模拟干旱胁迫处理下，猪苓菌丝具有一定的自我调节能力，以缓解干旱胁迫的抑制作用。

图2 不同干旱胁迫条件下猪苓菌丝中抗氧化酶活性Fig.2 Antioxidant enzyme activities of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

2.1.3 菌丝中丙二醛(MDA)质量摩尔浓度 不同质量浓度PEG-6000处理对液体培养猪苓菌丝中MDA质量摩尔浓度的影响较大，如图3-A所示。猪苓菌丝中MDA质量摩尔浓度随PEG-6000质量浓度升高呈先升高后降低的趋势。当PEG-6000质量浓度为50～150 g/L时，MDA质量摩尔浓度显著高于对照组。当PEG-6000质量浓度为150 g/L时，MDA质量摩尔浓度最高，较对照组显著增加61.01%。当PEG-6000质量浓度>150 g/L时，MDA质量摩尔浓度呈下降趋势。当PEG-6000质量浓度为200 g/L时，MDA质量摩尔浓度与对照组无显著差异；当PEG-6000质量浓度为250 g/L时，MDA质量摩尔浓度显著低于对照组。

2.1.4 菌丝中游离脯氨酸(Pro)质量分数 不同质量浓度PEG-6000处理对液体培养猪苓菌丝中游离脯氨酸质量分数的影响较大，如图3-B所示。猪苓菌丝中游离脯氨酸质量分数随PEG-6000质量浓度升高呈先降低后升高的趋势。其中，对照组游离脯氨酸质量分数最高，且显著高于各处理组。当PEG-6000质量浓度为50～150 g/L时，猪苓菌丝中游离脯氨酸的质量分数呈下降趋势。当PEG-6000质量浓度为150 g/L时，猪苓菌丝中游离脯氨酸的质量分数最低，较对照组显著减少59.61%。当PEG-6000质量浓度>150 g/L 时，猪苓菌丝中游离脯氨酸的质量分数呈上升趋势，但在试验范围内显著低于对照组。当PEG-6000质量浓度为100～250 g/L时，不同处理组间游离脯氨酸的质量分数差异不显著。

2.1.5 菌丝中可溶性蛋白质量分数 不同质量浓度PEG-6000处理对液体培养猪苓菌丝中可溶性蛋白质量分数的影响较小，如图3-C所示。猪苓菌丝中可溶性蛋白质量分数随PEG-6000质量浓度升高呈先升高后降低的趋势。当PEG-6000质量浓度为50～100 g/L时，可溶性蛋白质量分数呈上升趋势，与对照组无显著差异。其中，当PEG-6000质量浓度为100 g/L时，可溶性蛋白质量分数最高，较对照组增加8.80%。PEG-6000质量浓度>100 g/L时，猪苓菌丝中可溶性蛋白质量分数呈下降趋势。当PEG-6000质量浓度为150 g/L时，可溶性蛋白质量分数较对照组增加 6.98%，二者差异不显著。而PEG-6000质量浓度为200～250 g/L时，可溶性蛋白质量分数分别较对照组显著降低15.30%和20.12%。

以上研究结果表明，干旱胁迫会引起猪苓菌丝细胞损伤，适度干旱胁迫条件下猪苓菌丝具有一定的自我调节能力，以缓解干旱胁迫的抑制 作用。

图3 不同干旱胁迫条件下猪苓菌丝中丙二醛质量摩尔浓度(A)、游离脯氨酸质量分数(B)及可溶性蛋白质量分数(C)Fig.3 MDA molality (A) , proline mass fraction (B) andsoluble protein mass fraction(C) of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

2.2 不同质量浓度PEG-6000处理对猪苓菌丝中多糖质量分数的影响

不同质量浓度PEG-6000处理对液体培养猪苓菌丝中多糖质量分数的影响较大，如图4所示。猪苓菌丝中多糖质量分数随PEG-6000质量浓度升高呈先升高后降低的趋势。当PEG-6000质量浓度≤100 g/L时，多糖质量分数呈上升趋势。当PEG-6000质量浓度为100 g/L时，多糖质量分数最高，较对照组显著增加1.06倍。当PEG-6000质量浓度>100 g/L时，多糖质量分数呈下降趋势，但在试验范围内均高于对照组。当PEG-6000质量浓度为150 g/L和200 g/L时，多糖质量分数分别较对照组显著增加57.61%和 22.73%。当PEG-6000质量浓度为250 g/L时，多糖质量分数与对照组差异显著。适度干旱胁迫能够提高液体培养猪苓菌丝中多糖的质量分数。

图4 不同干旱胁迫条件下猪苓菌丝中多糖质量分数Fig.4 Polysaccharide mass fraction of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

2.3 不同质量浓度PEG-6000处理对猪苓菌丝中多糖合成相关酶活性的影响

2.3.1 己糖激酶(HK)活性 不同质量浓度PEG-6000处理对液体培养猪苓菌丝中HK活性的影响较大，如图5-A所示。不同质量浓度PEG-6000处理下，猪苓菌丝中HK活性与多糖质量分数变化趋势一致，呈先升高后降低的趋势。当PEG-6000质量浓度为50 g/L时，猪苓菌丝中HK活性升高，与对照组无显著差异。当PEG-6000质量浓度为100 g/L时，HK活性较对照组显著升高27.88%。当PEG-6000质量浓度>100 g/L时，HK活性呈下降趋势。当PEG-6000质量浓度为150 g/L时，HK活性较对照组升高 5.30%，二者差异不显著。当PEG-6000质量浓度为200 g/L和250 g/L时，HK活性分别较对照组显著降低15.58%和29.75%。

2.3.2 磷酸葡萄糖异构酶(GPI)活性 不同质量浓度PEG-6000处理对液体培养猪苓菌丝中GPI活性的影响较大，如图5-B所示。猪苓菌丝中GPI活性与多糖质量分数变化趋势一致，呈先升高后降低的趋势。当PEG-6000质量浓度为50 g/L时，GPI活性较对照组显著增加10.60%。当PEG-6000质量浓度为100 g/L时，GPI活性达到最高，较对照组显著增加19.89%。当PEG-6000质量浓度>100 g/L时，GPI活性呈下降趋势，但在试验范围内显著高于对照组。当PEG-6000质量浓度为150～250 g/L时，GPI活性分别较对照组显著增加16.54%、13.80%和 11.94%。

2.3.3 α-磷酸葡萄糖变位酶(α-PGM)活性 不同质量浓度PEG-6000处理对液体培养猪苓菌丝中α-PGM活性的影响较大，如图5-C所示，猪苓菌丝中α-PGM活性与多糖质量分数变化趋势一致，呈先升高后降低的趋势。各处理组α-PGM活性均高于对照组。当PEG-6000质量浓度为100、150和200 g/L时，α-PGM活性分别较对照组显著增加28.73%、18.53%和15.73%。当PEG-6000质量浓度为50 g/L和250 g/L时， α-PGM活性分别较对照组增加6.10%和 2.11%，差异不显著。

以上研究结果表明，猪苓菌丝中己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、α-磷酸葡萄糖变位酶活性与猪苓多糖质量分数变化趋势一致，且适度干旱胁迫可以提高其活性。

图5 不同干旱胁迫条件下猪苓菌丝中己糖激酶(A)、磷酸葡萄糖异构酶(B)和α-磷酸葡萄糖变位酶(C)活性Fig.5 Activities of HK (A), GPI (B) and α-PGM (C) of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

3 结论与讨论

高巧妮等[13]研究发现，猪苓菌核培养过程中水分变化会对猪苓菌丝生长产生重要影响。本研究通过外源添加PEG-6000模拟干旱胁迫，探究其对猪苓菌丝生长及多糖合成相关酶活性的影响。结果表明，在不同质量浓度PEG-6000模拟干旱胁迫下，猪苓菌丝生长和多糖合成相关酶活性均受到一定影响。

水分是中药材人工栽培过程中影响药材产量的重要因素。干旱胁迫抑制植株生长，且抑制作用随胁迫程度增大而增大。刘艳等[14]研究结果表明，轻度干旱胁迫促进甘草根系生长。高扬[15]研究结果表明，中度干旱胁迫抑制丹参干物质积累。本研究结果表明，PEG-6000质量浓度≤150 g/L时促进猪苓菌丝生长，PEG-6000质量浓度为250 g/L时显著抑制猪苓菌丝生长。

SOD、POD和CAT是生物体内的保护酶，与机体抗逆性紧密相关，本研究结果表明，当猪苓菌丝遭受不同程度干旱胁迫时，这3种酶表现出不同的活性。当PEG-6000质量浓度≤150 g/L时，猪苓菌丝中SOD和POD活性显著升高，CAT活性显著降低，说明猪苓菌丝具有一定适应干旱胁迫的能力。当PEG-6000质量浓度>150 g/L时，猪苓菌丝生物量、POD活性、SOD活性、MDA质量摩尔浓度、可溶性蛋白质量分数及多糖质量分数均随胁迫程度增大显著降低。说明猪苓菌丝适应干旱胁迫能力具有一定范围，超过此范围会导致猪苓菌丝中保护酶功能失衡，过氧化程度加剧，造成细胞损伤。

干旱是全球普遍存在的现象，全球气候变暖和雨水不均导致的干旱胁迫会对作物生长及次生代谢物合成产生影响。中药材人工栽培过程中常受到干旱的影响，但适度干旱胁迫有利于道地药材形成[16]。周雪洁等[17]研究结果表明，中度干旱胁迫后短期复水可以促进甘草酸积累。高扬[15]研究结果表明，中度干旱促进丹参中丹参素和丹参酮ⅡA的积累。本研究结果表明，适度干旱胁迫有利于提高猪苓菌丝中的多糖质量分数，并提高多糖合成相关酶活性，多糖质量分数与HK、GPI和α-PGM 3种酶活性变化趋势一致，此结果与余吴梦晓等[18]及李洁[19]的研究结果一致。目前猪苓多糖合成代谢途径尚不明确，但有关多糖合成酶的相关研究却较多。有研究表明，HK在糖核苷酸合成途径以及糖代谢途径中可能扮演重要角色[20-22]，GPI和α-PGM是多糖合成途径的关键酶[23-28]，该3种酶是否为猪苓多糖合成的关键酶还有待进一步研究。