黄野螟蜕皮激素受体基因HvEcR的鉴定及表达分析

2019-07-29吕子豪李治兴

西北农业学报 2019年7期

吕子豪，李治兴，林同

(华南农业大学林学与风景园林学院，广州 510642)

黄野螟(HeortiavitessoidesMoore)是一种寡食性的食叶害虫[1-2]，其寄主为国家二级重点保护野生植物土沉香(AquilariasinensisSprenger)[3]。该虫生长季节虫口爆发迅速，数日便可把叶片吃光，造成枯苗、死苗，严重影响植株生长，制约结香的产量与质量，造成极大的经济损失[1,4]。近年来，国内外关于黄野螟的研究大多集中在生物学特性、行为学、农药防治技术方面，关于昆虫生长调节剂防治及其分子方面的研究鲜见报道。

蜕皮激素核受体EcR是核受体超家族成员[5]，最早在果蝇(Drosophilamelanogaster)中得到鉴定[6]，具有蜕皮激素(Ecdysteroid hormones, EH) 配体专一性[7]， EH通过其进行信号转导。高20E浓度条件下，EcR与另一个蜕皮激素受体——超气门蛋白(Ultraspiracle，USP)会被诱导形成异二聚体，进而激活一系列早期应答基因与晚期基因的表达[8-11]。因此，EcR在昆虫蜕皮和变态过程中具有重要作用。

蜕皮是由数种激素协同调控的昆虫生长发育所必需的复杂生命过程[12]，蜕皮激素与保幼激素(Juvenile hormone，JH)的协同作用在此过程中发挥关键作用。蜕皮激素需经过一系列羟基化作用，被激活为具有更高活性的20-羟基蜕皮酮(20E)才能发挥作用[13-16]。当JH滴度较高时，20E引起昆虫脱皮，当JH滴度较低，20E诱导昆虫进入下一龄期或发生变态[17]。EcR接受20E信号后，一系列蜕皮级联反应将被启动。因此，研究昆虫的EcR基因具有相当的分子生物学意义。本研究利用RT-qPCR技术检测HvEcR基因在黄野螟各发育阶段及幼虫组织中的转录水平，同时明确HvEcR的表达量对20E胁迫的响应，丰富了EcR的分子生物学信息。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

于广州天鹿湖森林公园采集虫卵及1至5龄试虫，饲喂新鲜土沉香叶片，室内饲养条件为：温度26 ℃，相对湿度75%，光期14 h，暗期10 h。20E试剂购自上海源叶生物科技有限公司。总RNA提取试剂盒(E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ)购自OMEGA公司；反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser)及实时荧光定量试剂盒(TB GreenTMPremix Ex TaqTM)均购自TaKaRa公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理野外采集工作后，立即用液氮处理卵(3片)及各虫态幼虫(各5头)，存放于 -80 ℃冰箱中；其余个体饲养至老熟幼虫时，转移到铺有2 cm厚沙土(相对湿度为50%)的塑料养虫盒中，待其化蛹羽化后，用同样方法收集蛹及成虫(各5头)。选取40头健康的4～5龄幼虫，经清洗、消毒后，在腊盘上解剖，获取幼虫体壁、头、脂肪体、中肠、马氏管等组织样品，立即置于无菌去酶的冻存管中，经液氮速冻后，存放于 -80 ℃冰箱。

1.2.2 蜕皮激素胁迫处理先用DMSO将20E稀释至10 mg/mL，存放于-20℃冰箱，备用。试验时用1×PBS将20E稀释至30 ng/ μL和150 ng/ μL 2个质量浓度。采用注射法对4龄幼虫进行蜕皮激素胁迫，用φ=75%酒精擦拭虫体，虫体置于冰上麻醉后，从腹部侧面注射。每头虫子注射1 μL液体，对照组为等量稀释的DMSO。注射后继续用沉香叶片饲养于人工气候箱中，分别于注射后24、48、72 h取样。

1.2.3 RNA提取与cDNA合成严格按照E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ试剂盒说明书提取各样本总RNA，经琼脂糖凝胶电泳以及微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000)检测合格后，置于 -80 ℃冰箱保存，备用。严格按照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒说明书，将总RNA(0.8 μg)逆转录为第一链cDNA，稀释20倍后，置于-20 ℃冰箱保存，备用。

1.2.4 基因表达从黄野螟转录组文库筛选出具有完整ORF框的EcR基因序列，用实时荧光定量PCR反应(RT-qPCR)检测其表达量，所用内参基因为β-actin；所用目的基因引物为：Forward:5′-GCCAACCAGCAGTTCCTCATCG-3′和Reverse:5′-CGTCCTCTTCCTCCGTTGATTGC-3′；阴性对照为无菌超纯水处理；反应体系包括cDNA模板 20 μL，TB Green Premix ExTaq 10.0 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃解链10 s，60 ℃延伸20 s，共进行40个循环。每个样本设置3个技术重复，根据反应结束后的Ct值，使用2-△△Ct相对定量法计算HvEcR相对表达量。用Excel进行统计分析，采用SPSS 18.0进行单因素方差分析与邓肯分析。

1.3 生物信息学分析、同源比对及系统发育树构建

在multalin网站(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)进行氨基酸序列同源比对，采用ExPASy-ProtPram软件进行蛋白质理化性质预测，采用PSORT在线工具(https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl)预测亚细胞定位，采用NPS在线工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4. pl)预测蛋白质二级结构，采用SWISS-MODEL在线工具(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive/yrSsgx/models/)模拟EcR蛋白高级结构，采用ClustalX软件和MEGA 5.0软件构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 HvEcR基因序列及蛋白高级结构分析

从黄野螟转录组文库中筛选出具有完整ORF框的目的片段，将其命名为HvEcR(登录号：MH588318)，序列全长1 734 bp，包含1 638 bp长的ORF框，共编码545个氨基酸。使用ProtPram软件对HvEcR的理化性质进行分析，结果表明，该蛋白的分子质量为61.70 ku，理论等电点为5.89，脂肪指数为73.71，不稳定性指数为68.47，为不稳定蛋白，总平均疏水性为 -0.442，为亲水性蛋白。NetPhos 3.1软件的预测结果为：HvEcR含丝氨酸位点16个，苏氨酸和酪氨酸位点各2个(得分大于0.9)。

Signal P 4.1软件预测结果为：HvEcR不存在信号肽，为非分泌蛋白。根据PSORTII软件预测的亚细胞定位结果可知，HvEcR位于线粒体的可能性最大，为60.9%，其次是细胞核和细胞质，分别有26.1%和8.7%的可能性，位于细胞骨架可能性则较低，仅为4.3%。TMpred软件跨膜区分析结果为，无得分大于500的跨膜螺旋。TMHMM 软件基于隐马尔可夫模型(hidden Markov model)的跨膜螺旋预测结果为，HvEcR被标记在外部，不含跨膜螺旋。蛋白的疏水性越强，其疏水区为跨膜区的可能性就越大，HvEcR无跨膜区，符合上文的亲水性预测结果。

Conserved Domains软件分析表明(图1)，HvEcR含有EcR家族典型的DNA结合域(DNA binding domain，DBD)和配体结合域(Ligand binding domain，LBD)。SMART软件分析显示，HvEcR由6个功能结构域组成，分别为两段锌指结构域(zinc finger，ZF)，3个低密度复杂区(low complexity region，LCR)和1个配体结合域(图2)。这两个软件的分析结果进一步证明筛选出的HvEcR基因与其他昆虫的EcR一样，均为核受体家族成员。经SOPMA和SWISS-MODEL软件进行蛋白质结构预测和建模，结果显示，HvEcR编码的蛋白主要由α-螺旋与无规则螺旋组成，它们分别占36.15%和48.62% (图3)。

图1HvEcR蛋白序列的保守结构域预测Fig.1 Putative conserved domain of HvEcR

低密度复杂区以大括号标注；锌指结构域以阴影标注；配体结构域以方框标注；终止密码子TAG以星号标注 LCRs are marked in braces; ZFs are marked with shadow; LBD is marked with boxes; the termination codon is marked with asterisk

图2 黄野螟EcR基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences ofEcRgene fromH.vitessoides

图中彩虹条表示从N端到C端的氨基酸 The rainbow bar represents the amino acid from N-terminal to C-terminal

图3HvEcR的三维结构
Fig.3 Three-dimensional structure ofHvEcR

2.2 同源比对及系统发育树

在NCBI网站上进行同源搜索，用multalin软件进行同源比对，结果表明，HvEcR序列与三化螟和二化螟的同源性最高，分别高达96%和92%(图4)。基于鳞翅目12种昆虫的EcR氨基酸序列，采用NJ法构建系统发育树，结果表明，黄野螟与水稻三化螟和二化螟的亲缘关系最近，结果与同源性比对一致(图5)。

2.3 黄野螟HvEcR基因的时空动态表达

黄野螟发育阶段表达谱显示(图6)，以HvEcR在卵期的表达量为对照，HvEcR的转录水平在各发育时期差异显著，在成虫时达到峰值，为对照的12倍；其次是5龄幼虫时，为对照的 5.68倍。在3龄幼虫时表达量最低，仅为卵的 0.22。

由图7可知，HvEcR在黄野螟幼虫各组织中均有表达，在体壁中表达量最低，设为对照；在脂肪体中表达较高，为对照的4.54倍。其次，HvEcR在头与马氏管中也有较高表达，分别为对照的2.85倍和2.49倍。

用质量浓度分别为30 ng/μL、150 ng/μL的蜕皮激素溶液和等量稀释的DMSO溶液处理黄野螟4龄幼虫，于处理后24 h、48 h和72 h检测HvEcR基因的表达情况。RT-qPCR结果显示(图8)，在两种质量浓度处理24 h后，均能引起HvEcR基因的表达量上调。在注射质量浓度为150 ng/μL，处理时间为48 h时，HvEcR表达量上调最为明显，为对照的4.10倍。结果表明，HvEcR基因的表达受20E调控。

3 讨论

本研究鉴定1条黄野螟HvEcR基因，其编码的氨基酸含2个锌指结构域、1个配体结构域和3个低密度复杂区等6个保守结构域，具有与其他昆虫EcR相似的典型的基因家族特征。HvEcR与其他鳞翅目昆虫EcR的亲缘关系较近，在进化过程中十分保守。

作为蜕皮激素的受体，HvEcR的表达水平可能与20E滴度密切相关[18]，本研究结果显示，黄野螟HvEcR的表达水平可能受20E的诱导调节(图8)。蜕皮激素与保幼激素共同参与每一龄幼虫的组织重建和表皮形成[19]。RT-qPCR结果显示，HvEcR在卵期及1～4龄幼虫时表达量较低且相对稳定，到5龄时达到小高峰，到蛹期又降低，与昆虫不同发育时期体内蜕皮激素的变化趋势一致[20-21]。因此，推测HvEcR对黄野螟末龄幼虫的发育起重要作用，可能与组织重建和预蛹发育有关[22]。蜕皮激素参与昆虫成虫的卵子发生和生殖过程[17]，在黄野螟成虫体内，HvEcR有高表达，推测作为蜕皮激素受体的EcR也与该过程有关[23]。

图5 基于昆虫EcR氨基酸序列构建的系统发育树Fig.5 Phylogenetic relationships of insects based on amino acids of EcR

EcR存在昆虫不同组织中，参与20E介导下的组织重建，如EcR在埃及伊蚊 (Aedesaegypti)幼虫中参与组织溶解过程，在家蚕和水稻二化螟幼虫脂肪体中特异性表达，在果绳中参与神经元重建[24-27]。对黄野螟幼虫不同组织的HvEcR转录水平进行检测，发现其主要在脂肪体中表达，为对照的4.54倍。脂肪体是昆虫重要的能量贮备中心，且在物质代谢中扮演关键角色，作为蜕皮激素受体，HvEcR可能与黄野螟营养储存及能量代谢有关。除在脂肪体表达外，HvEcR在马氏管和头部中也有较高表达，但其功能需进一步澄清。

数据为“平均数±标准差”；柱上字母代表差异显著(P< 0.05)；图7、图8同 Data in the figure are represented as mean ± SD；different letters mean significant difference on the bar (P<0.05). The same as Fig.7 and 8;E.卵 Egg；L1、L2、L3、L4、L5.1～5龄幼虫 Larve stage 1-5；P.蛹 Pupal；A.成虫 Adult

图6HvEcR基因在黄野螟各发育时期的表达
Fig.6 The expression level ofHvEcRindevelopmental stages ofH.vitessoides