猪苓菌核共生营养优势蜜环菌初步筛选
2021-10-06韦中强
韦中强,肖 波,李 娜,韩 量,秦 静
(重庆市药物种植研究所/重庆市中药良种选育与评价工程技术中心,重庆 408435)
猪苓(Polyporus umbellatus)别名野猪苓、猪屎苓、鸡屎苓、猴猪屎、地乌桃,属胆子菌亚门层菌纲非裕菌目多孔菌科多孔菌属。猪苓为传统常用名贵中药材,在我国已有2 000 多年的用药历史,《神农本草经》将其列为中品,其“味甘,治痞疟,解毒,蛊注不祥,利水道,久服轻身不老。”其菌核具有利水渗湿作用[1]。自古以来我国一些民间和中医就有猪苓治疗症癜积聚和肿瘤等症。近年来,随着抗癌药的热销及猪苓为原料的中成药开发,市场需求急剧增长,猪苓供需矛盾日趋尖锐,野生猪苓资源遭到过度采挖,已日益枯竭[2],已被我国列为“三级保护野生中药材”。同时,使得猪苓的生产方式向人工种植发展,家种猪苓与野生猪苓的化学成分无明显的差异[3],在栽培过程中,蜜环菌是猪苓菌核生长关键必备的伴生菌[4-5],因此对猪苓菌核生长发育优势蜜环菌作了初步筛选,以期筛选出猪苓菌核亲和力强的优势蜜环菌菌株,应用于生产,为提高猪苓产业的技术水平和规模发展奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株
供试蜜环菌菌株引自国内猪苓和天麻主产区,菌株及来源见表1;蜜环菌菌株A9,由陕西省西乡县食用菌研究所提供;猪苓菌株选用生长性能表现较好的Pu-1,由陕西省西乡县食用菌研究所提供;猪苓菌核形成伴生菌,由重庆市药物种植研究所药用菌研究中心提供。
表1 蜜环菌菌株及来源
1.1.2 培养基
PDA(Potato Dextrse Agar)培养基配方:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂15~20 g,自来水1 000 mL,pH 自然。
麦麸培养基配方:麦麸93.00%,葡萄糖2.00%,KH2PO40.30%,MgSO4·7H2O 0.15%,琼脂1.00%。
1.1.3 栽培树棒
准备直径6 cm 粗、30 cm 长的栓皮栎树棒,用于猪苓栽培,截取树枝培养Gu-7(药植1 号)蜜环菌菌株备用。
1.2 试验方法
1.2.1 不同来源蜜环菌菌株生长速率考察
于25 ℃条件下,将7 个蜜环菌菌株母种分别转接到PDA 培养基斜面上培养活化;分别转接 PDA 平板培养备用,将培养好的7 个供试菌株分别用孔径为0.6 cm 打孔器边缘取样,置于新的PDA 平板培养基中心,盖上培养皿盖25 ℃恒温培养,待菌丝萌动后,每隔24 h 测量1 次菌落直径(取3 个方向的平均值),直到菌丝长满整个平板为止,计算出蜜环菌在PDA 平板培养基上的平均生长速度。每个菌株3 次重复。
1.2.2 不同蜜环菌菌株液体发酵菌丝体生长干重
将液体PDA培养基装入250 mL三角瓶中,常规灭菌,在灭菌后的三角瓶培养基中分别接入0.5 cm2的蜜环菌菌块,在25 ℃条件下摇床培养。培养20 d 后,分别将菌丝取出,并用蒸馏水冲洗菌丝体数次,洗掉菌丝体上的培养液,然后置于60 ℃烘箱中烘至恒重,再称其干重。每个试验设置重复3 次。
1.2.3 蜜环菌发酵液对猪苓菌丝生长影响
将蜜环菌菌株Gu-7、A9 分别接种于PDA 液体培养基中,25 ℃、120 r·min-1暗培养14 d 提取发酵液,按发酵液10 mL/皿分别制PDA 平板,分别接种猪苓Pu-1 菌丝进行培养,以不含发酵液PDA 平板培养为对照。菌丝萌动后每日同一时间测量菌落直径,每次测3 个方向取平均值,做好记录直至满皿。
1.2.4 猪苓菌核诱导试验
树棒栽培猪苓,将准备好的树棒每隔5~8 cm 砍1个鱼鳞口;准备少量并间隔3 cm 沿纵向截取0.5~1.0 cm厚表皮的树棒。取猪苓菌种和猪苓菌核伴生菌分别接于650 mL 棕色广口瓶中的麦麸培养基上,置于(23±2)℃条件下避光培养,培养好备用,取出已培养感染药植1号蜜环菌菌株的细树枝。按如下方法诱导栽培。
诱导方法1:在花盆的底部平铺3~4 cm 厚的粗砂,上放已感染蜜环菌菌索的细树枝(见图1),用粗沙覆盖,厚度8 cm;其上放树棒,将长满广口瓶的猪苓菌种和猪苓菌丝形成菌核伴生菌分别取出,间隔接种于的鱼鳞口内;树棒的两侧各放置1~2 个猪苓菌核作引子。之后用粗砂覆盖,厚度为5 cm。
诱导方法2:方法1 中改放树棒,间隔接猪苓菌种和伴生菌于去掉表皮树棒的纵截面上,之后盖上其树皮。其余相同。
诱导方法3:方法1 中改放树棒,接猪苓菌种于树棒两端的截面处;接伴生菌于棒中间所砍鱼鳞口内。其余相同。
诱导方法4:方法1 中放已感染蜜环菌菌索的细树枝后,改粗砂覆盖厚度1 cm。其余相同。
诱导方法5:方法1 中不放蜜环菌菌枝;其余相同。
诱导方法6:方法1 中不放猪苓菌核作引子;其余相同。
诱导方法7:方法1 中不接伴生菌;其余相同,本方法为对照。
对照和每1 诱导方法(处理)分别重复5 次。浇水保持湿度,(23±2)℃条件下培养。
2 结果与分析
2.1 不同来源蜜环菌菌株生长速率
菌丝体的生长,在营养供应等条件适宜的情况下没有明显的波动,大体上呈匀速生长。培养3 d 后开始出现菌索,平板培养的第5 d,菌落直径约为培养皿直径的2/3,按照此时的菌落直径计算菌丝日平均生长速度,见表2。
表2 不同蜜环菌菌株菌丝生长速率
根据结果,不同蜜环菌菌株菌丝的日平均生长速度从大到小的顺序为Gu-7 >Gu-5 >Gu-3 >Gu-6 >Gu-1 >Gu-2 >Gu-4,说明Gu-7,Gu-5,Gu-3 菌株的生长性能较为优势。
2.2 不同蜜环菌菌株液体发酵菌丝体生长干重
经发酵培养,不同来源蜜环菌菌株菌丝体干重统计结果见表3。
表3 不同蜜环菌菌株菌丝干重
试验结果表明:7 株蜜环菌菌株液体培养菌丝体干重以Gu-7 最高(4.76 mg/10 mL),其次是Gu-5(4.25 mg/10 mL),最低为Gu-4(2.24 mg/10 mL),说明Gu-7、Gu-5、Gu-3 菌株的液体发酵生长性能较佳。
2.3 蜜环菌发酵液对猪苓菌丝生长的影响
不同来源蜜环菌发酵液对猪苓菌丝生长的影响观察,观察到两株蜜环菌发酵液处理的猪苓菌丝生长情况均较稳定(见图1),并且这两种蜜环菌发酵液处理的猪苓菌丝生长情况均好于对照(CK),并测定猪苓菌丝生长速率统计结果见表4。
图1 培养的蜜环菌树枝菌种
表4 固体培养的猪苓菌丝平均生长速率
试验结果表明,供试两株蜜环菌发酵液处理的猪苓菌丝平均生长速率都高于CK,并且A9、药植1 号发酵液对猪苓菌丝生长起到促进作用,A9 处理的猪苓菌丝平均生长速率与药植1 号,差异不明显,与对照相比达显著水平。
2.4 猪苓菌核诱导试验
树棒栽培诱导猪苓菌核播种后120 d,试验观察结果见表5。从表中不同诱导方法对猪苓菌丝形成菌核影响可以看出,诱导方法1、诱导方法2、诱导方法5、诱导方法6 猪苓菌株和伴生菌均生长良好,菌核形成较快,数量较多,见图2。诱导方法3 形成的菌核较少,诱导方法4和7 无菌核形成。猪苓生产菌核形成是关键,猪苓菌核后续生长需要共生蜜环菌提供营养,观察到蜜环菌感染了猪苓菌核,菌索侵入了菌核,见图3,为猪苓生长提供营养。
图2 诱导形成猪苓菌核
表5 不同栽培方法对猪苓菌丝形成菌核的影响
图3 蜜环菌侵染猪苓菌核生长情况
树棒诱导栽培,从栽培角度综合考虑,诱导方法6优于其他诱导方法,该方法有利于提供大量的菌核,适用于大面积生产,当猪苓菌核形成后蜜环菌侵入菌核,持续提供猪苓菌核继续生长发育的营养。
3 结论与讨论
猪苓生产中,猪苓菌核形成后,后续生长必需依靠共生蜜环菌提供营养,支撑其发育繁殖形成猪苓商品,所以优良的蜜环菌菌株对猪苓生产尤其重要。本试验结果表明,蜜环菌Gu-7 菌株日生长速率6.130 mm·d-1和菌丝体干重4.76 mg/10 mL)是7 株供试菌株中较为突出,表现出生长性能优势的菌株。蜜环菌对猪苓菌核是从灰苓阶段起侵入的,在树棒栽培中也观察到蜜环菌菌索侵染灰苓,菌核前段白苓没有菌索侵染,说明中间猪苓与蜜环菌存在一定的识别机制,这与已报道的研究类似。蜜环菌Gu-7、A9 发酵液对猪苓菌丝生长有明显的促进作用,根据王秋颖等人的研究结果也得到了印证[6]。传统猪苓栽培一般采用小菌核作种源,由于猪苓菌核生长缓慢、生产周期较长(一般3~5 年)、繁殖率低、投种量较大,很难提供大量猪苓小菌核用于人工栽培,苓种匮乏,是制约人工栽培猪苓产量、质量及效益的主要因素;运用大量生产的蜜环菌Gu-7 菌株,并通过本试验7 种猪苓菌核诱导栽培模式探讨,诱导方法1、诱导方法2、诱导方法5 和诱导方法6 能较快培育大量种苓,有利于猪苓大面积推广栽培。栽培方法6 优势明显,在优质蜜环菌共生条件下,有利于猪苓菌核生长形成商品。但有待进一步探讨蜜环菌对猪苓商品产量、质量形成的影响。