猪苓菌核共生营养优势蜜环菌初步筛选

韦中强，肖 波，李 娜，韩 量，秦 静

（重庆市药物种植研究所/重庆市中药良种选育与评价工程技术中心，重庆 408435）

猪苓（Polyporus umbellatus）别名野猪苓、猪屎苓、鸡屎苓、猴猪屎、地乌桃，属胆子菌亚门层菌纲非裕菌目多孔菌科多孔菌属。猪苓为传统常用名贵中药材，在我国已有2 000 多年的用药历史，《神农本草经》将其列为中品，其“味甘，治痞疟，解毒，蛊注不祥，利水道，久服轻身不老。”其菌核具有利水渗湿作用［1］。自古以来我国一些民间和中医就有猪苓治疗症癜积聚和肿瘤等症。近年来，随着抗癌药的热销及猪苓为原料的中成药开发，市场需求急剧增长，猪苓供需矛盾日趋尖锐，野生猪苓资源遭到过度采挖，已日益枯竭［2］，已被我国列为“三级保护野生中药材”。同时，使得猪苓的生产方式向人工种植发展，家种猪苓与野生猪苓的化学成分无明显的差异［3］，在栽培过程中，蜜环菌是猪苓菌核生长关键必备的伴生菌［4-5］，因此对猪苓菌核生长发育优势蜜环菌作了初步筛选，以期筛选出猪苓菌核亲和力强的优势蜜环菌菌株，应用于生产，为提高猪苓产业的技术水平和规模发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

供试蜜环菌菌株引自国内猪苓和天麻主产区，菌株及来源见表1；蜜环菌菌株A9，由陕西省西乡县食用菌研究所提供；猪苓菌株选用生长性能表现较好的Pu-1，由陕西省西乡县食用菌研究所提供；猪苓菌核形成伴生菌，由重庆市药物种植研究所药用菌研究中心提供。

表1 蜜环菌菌株及来源

1.1.2 培养基

PDA（Potato Dextrse Agar）培养基配方：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，自来水1 000 mL，pH 自然。

麦麸培养基配方：麦麸93.00%，葡萄糖2.00%，KH2PO40.30%，MgSO4·7H2O 0.15%，琼脂1.00%。

1.1.3 栽培树棒

准备直径6 cm 粗、30 cm 长的栓皮栎树棒，用于猪苓栽培，截取树枝培养Gu-7（药植1 号）蜜环菌菌株备用。

1.2 试验方法

1.2.1 不同来源蜜环菌菌株生长速率考察

于25 ℃条件下，将7 个蜜环菌菌株母种分别转接到PDA 培养基斜面上培养活化；分别转接 PDA 平板培养备用，将培养好的7 个供试菌株分别用孔径为0.6 cm 打孔器边缘取样，置于新的PDA 平板培养基中心，盖上培养皿盖25 ℃恒温培养，待菌丝萌动后，每隔24 h 测量1 次菌落直径（取3 个方向的平均值），直到菌丝长满整个平板为止，计算出蜜环菌在PDA 平板培养基上的平均生长速度。每个菌株3 次重复。

1.2.2 不同蜜环菌菌株液体发酵菌丝体生长干重

将液体PDA培养基装入250 mL三角瓶中，常规灭菌，在灭菌后的三角瓶培养基中分别接入0.5 cm2的蜜环菌菌块，在25 ℃条件下摇床培养。培养20 d 后，分别将菌丝取出，并用蒸馏水冲洗菌丝体数次，洗掉菌丝体上的培养液，然后置于60 ℃烘箱中烘至恒重，再称其干重。每个试验设置重复3 次。

1.2.3 蜜环菌发酵液对猪苓菌丝生长影响

将蜜环菌菌株Gu-7、A9 分别接种于PDA 液体培养基中，25 ℃、120 r·min-1暗培养14 d 提取发酵液，按发酵液10 mL/皿分别制PDA 平板，分别接种猪苓Pu-1 菌丝进行培养，以不含发酵液PDA 平板培养为对照。菌丝萌动后每日同一时间测量菌落直径，每次测3 个方向取平均值，做好记录直至满皿。

1.2.4 猪苓菌核诱导试验

树棒栽培猪苓，将准备好的树棒每隔5～8 cm 砍1个鱼鳞口；准备少量并间隔3 cm 沿纵向截取0.5～1.0 cm厚表皮的树棒。取猪苓菌种和猪苓菌核伴生菌分别接于650 mL 棕色广口瓶中的麦麸培养基上，置于（23±2）℃条件下避光培养，培养好备用，取出已培养感染药植1号蜜环菌菌株的细树枝。按如下方法诱导栽培。

诱导方法1：在花盆的底部平铺3～4 cm 厚的粗砂，上放已感染蜜环菌菌索的细树枝（见图1），用粗沙覆盖，厚度8 cm；其上放树棒，将长满广口瓶的猪苓菌种和猪苓菌丝形成菌核伴生菌分别取出，间隔接种于的鱼鳞口内；树棒的两侧各放置1～2 个猪苓菌核作引子。之后用粗砂覆盖，厚度为5 cm。

诱导方法2：方法1 中改放树棒，间隔接猪苓菌种和伴生菌于去掉表皮树棒的纵截面上，之后盖上其树皮。其余相同。

诱导方法3：方法1 中改放树棒，接猪苓菌种于树棒两端的截面处；接伴生菌于棒中间所砍鱼鳞口内。其余相同。

诱导方法4：方法1 中放已感染蜜环菌菌索的细树枝后，改粗砂覆盖厚度1 cm。其余相同。

诱导方法5：方法1 中不放蜜环菌菌枝；其余相同。

诱导方法6：方法1 中不放猪苓菌核作引子；其余相同。

诱导方法7：方法1 中不接伴生菌；其余相同，本方法为对照。

对照和每1 诱导方法（处理）分别重复5 次。浇水保持湿度，（23±2）℃条件下培养。

2 结果与分析

2.1 不同来源蜜环菌菌株生长速率

菌丝体的生长，在营养供应等条件适宜的情况下没有明显的波动，大体上呈匀速生长。培养3 d 后开始出现菌索，平板培养的第5 d，菌落直径约为培养皿直径的2/3，按照此时的菌落直径计算菌丝日平均生长速度，见表2。

表2 不同蜜环菌菌株菌丝生长速率

根据结果，不同蜜环菌菌株菌丝的日平均生长速度从大到小的顺序为Gu-7 ＞Gu-5 ＞Gu-3 ＞Gu-6 ＞Gu-1 ＞Gu-2 ＞Gu-4，说明Gu-7，Gu-5，Gu-3 菌株的生长性能较为优势。

2.2 不同蜜环菌菌株液体发酵菌丝体生长干重

经发酵培养，不同来源蜜环菌菌株菌丝体干重统计结果见表3。

表3 不同蜜环菌菌株菌丝干重

试验结果表明：7 株蜜环菌菌株液体培养菌丝体干重以Gu-7 最高（4.76 mg/10 mL）,其次是Gu-5（4.25 mg/10 mL），最低为Gu-4（2.24 mg/10 mL），说明Gu-7、Gu-5、Gu-3 菌株的液体发酵生长性能较佳。

2.3 蜜环菌发酵液对猪苓菌丝生长的影响

不同来源蜜环菌发酵液对猪苓菌丝生长的影响观察，观察到两株蜜环菌发酵液处理的猪苓菌丝生长情况均较稳定（见图1），并且这两种蜜环菌发酵液处理的猪苓菌丝生长情况均好于对照（CK），并测定猪苓菌丝生长速率统计结果见表4。

图1 培养的蜜环菌树枝菌种

表4 固体培养的猪苓菌丝平均生长速率

试验结果表明，供试两株蜜环菌发酵液处理的猪苓菌丝平均生长速率都高于CK，并且A9、药植1 号发酵液对猪苓菌丝生长起到促进作用，A9 处理的猪苓菌丝平均生长速率与药植1 号，差异不明显，与对照相比达显著水平。

2.4 猪苓菌核诱导试验

树棒栽培诱导猪苓菌核播种后120 d，试验观察结果见表5。从表中不同诱导方法对猪苓菌丝形成菌核影响可以看出，诱导方法1、诱导方法2、诱导方法5、诱导方法6 猪苓菌株和伴生菌均生长良好，菌核形成较快，数量较多，见图2。诱导方法3 形成的菌核较少，诱导方法4和7 无菌核形成。猪苓生产菌核形成是关键，猪苓菌核后续生长需要共生蜜环菌提供营养，观察到蜜环菌感染了猪苓菌核，菌索侵入了菌核，见图3，为猪苓生长提供营养。

图2 诱导形成猪苓菌核

表5 不同栽培方法对猪苓菌丝形成菌核的影响

图3 蜜环菌侵染猪苓菌核生长情况

树棒诱导栽培，从栽培角度综合考虑，诱导方法6优于其他诱导方法，该方法有利于提供大量的菌核，适用于大面积生产，当猪苓菌核形成后蜜环菌侵入菌核，持续提供猪苓菌核继续生长发育的营养。

3 结论与讨论

猪苓生产中，猪苓菌核形成后，后续生长必需依靠共生蜜环菌提供营养，支撑其发育繁殖形成猪苓商品，所以优良的蜜环菌菌株对猪苓生产尤其重要。本试验结果表明，蜜环菌Gu-7 菌株日生长速率6.130 mm·d-1和菌丝体干重4.76 mg/10 mL）是7 株供试菌株中较为突出，表现出生长性能优势的菌株。蜜环菌对猪苓菌核是从灰苓阶段起侵入的，在树棒栽培中也观察到蜜环菌菌索侵染灰苓，菌核前段白苓没有菌索侵染，说明中间猪苓与蜜环菌存在一定的识别机制，这与已报道的研究类似。蜜环菌Gu-7、A9 发酵液对猪苓菌丝生长有明显的促进作用，根据王秋颖等人的研究结果也得到了印证［6］。传统猪苓栽培一般采用小菌核作种源，由于猪苓菌核生长缓慢、生产周期较长（一般3～5 年）、繁殖率低、投种量较大，很难提供大量猪苓小菌核用于人工栽培，苓种匮乏，是制约人工栽培猪苓产量、质量及效益的主要因素；运用大量生产的蜜环菌Gu-7 菌株，并通过本试验7 种猪苓菌核诱导栽培模式探讨，诱导方法1、诱导方法2、诱导方法5 和诱导方法6 能较快培育大量种苓，有利于猪苓大面积推广栽培。栽培方法6 优势明显，在优质蜜环菌共生条件下，有利于猪苓菌核生长形成商品。但有待进一步探讨蜜环菌对猪苓商品产量、质量形成的影响。