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化痰祛湿活血方对脂肪变L02细胞促炎抑炎因子的影响*

2019-07-28刘君颖张丽慧马庆亮刘雪涛赵文霞

中西医结合肝病杂志 2019年5期
关键词:性反应活血纤维化

刘君颖 张丽慧 桑 锋 马庆亮 刘雪涛 赵文霞

河南中医药大学第一附属医院 (河南 郑州, 450000)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的患病率有逐年升高趋势,已经成为21世纪第二大肝脏疾病[1]。NASH是向肝纤维化、肝硬化、肝癌发展的关键环节,其中促炎抑炎因子起到重要推动作用。有效治疗NASH,控制炎性细胞因子失衡,可逆转或延缓非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的进展[2,3]。化痰祛湿活血方是赵文霞教授近30年治疗NASH的经验方,前期临床及动物实验研究表明,该方能减轻肝脏炎性反应,改善肝细胞脂肪沉积,具有良好的保肝、降酶、抗纤维化作用[4,5]。通过对脂肪变细胞的研究,进一步明确化痰祛湿活血方对促炎抑炎因子的影响,探讨其抗炎作用机制,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 仪器:MK3酶标仪(Thermo Fisher),BX- 43光学显微镜(Olympas)、ABI7500荧光定量PCR仪(life technology公司)、TGL-16M低温冷冻离心机(湘仪)、SW-CJ-1D单人净化工作台(泸净净化)、HR40-Ⅱ A2生物安全柜(Haier)、SMA4000超微量分光光度计(Merinton)。

试剂:丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(伊莱瑞特,E-BC-K235)、天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)检测试剂盒(伊莱瑞特,E-BC-K236)、甘油三酯(TG)含量检测试剂盒(索莱宝,BC0625),肝癌坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10ELISA试剂盒(均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司,货号分别为 E-EL-H2306c、E-EL-H0149c、E-EL-H0102c、E-EL-H0103c)。荧光定量PCR检测转染主要实验材料:引物(life technology公司合成),BestarTMqPCR RT Kit(德国DBI,DBI-2220),BestarTMSybrGreen qPCR mastermix(德国DBI,DBI-2043),96孔板(美国life technology)。

1.2 中药含药血清的制备 化痰祛湿活血方组成:泽泻、海藻、决明子、郁金、丹参、山楂、柴胡、水飞蓟,以上药物均由四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供(批号分别为13120145、14040236、14070004、14010261、14010086、1420130、14010145、14010256)。

SD雄性大鼠60只,体重(200±10)g,动物合格证号:SCXK(豫)2010-0002;动物使用许可证号:SCXK(豫)2010-0001。随机分为化痰祛湿活血方组和空白组,每组30只。化痰祛湿活血方组大鼠按照每次0.5 ml/100 g体重灌胃化痰祛湿活血方药煎剂2次/d,连续3 d;空白组大鼠灌服去离子水。最后一次灌胃结束后1 h,采集大鼠腹主动脉血,离心,同组大鼠的血清混合,0.22 μm滤膜过滤,灭活、分装后储存于-70℃冰箱中。

1.3 脂肪变肝细胞模型复制及分组 常规培养L02细胞,采用油酸复制脂肪变肝细胞模型,油红O染色确定造模是否成功[6]。细胞分为空白组、模型组、脂联素(ADPN)组、化痰祛湿活血方含药血清组(简称中药组)。除空白组L02细胞加入等体积量的DMSO(二甲基亚砜)外,其余各组细胞均以终浓度为40 μmol/L的油酸处理24 h造模,ADPN组细胞加入ADPN,中药组细胞加入化痰祛湿活血方含药血清,孵育24 h收集细胞及上清液备测。

1.4 指标检测 ①化学发光法检测各组细胞上清液中ALT、AST、TG含量;②采用ELISA检测试剂盒检测细胞上清液中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 水平,严格按试剂盒说明书操作,根据标准曲线和OD值计算各组细胞TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10值。③采用荧光定量RT PCR方法检测各组细胞中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA的表达;提取各组细胞总mRNA,测定其浓度及纯度。反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA,设计并合成引物,采用荧光定量检测试剂盒于荧光定量PCR仪上扩增,根据Ct值计算TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA的相对表达。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结果

2.1 各组L02细胞上清液中ALT、AST、TG检测结果 见表1。

表1 各组L02细胞上清液中ACT、AST、TG结果比较

2.2 各组L02细胞上清液中炎症因子检测结果 见表2。

表2 各组L02细胞上清液中炎症因子检测结果比较

2.3 各组L02细胞TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA相对表达量比较 见表3。

表3 各组L02细胞上清液中24 h TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA相对表达量比较

3 讨论

NASH是向肝纤维化、肝硬化、乃至肝癌发展的关键环节,10~15年内肝硬化发生率高达15%~25%[7,8]。NASH的发生、发展与致炎因子和抗炎因子失衡有重要关系。IL具有非特异性免疫调节作用,是炎性反应中起重要作用的细胞因子。促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6等可引起炎性反应,抗炎因子IL-10具有负向调节作用。TNF-α的表达量与NASH严重程度呈正相关,能激活肝脏Kupffer细胞,释放IL-6、IL-8等大量炎性因子,引发瀑布反应,促进肝细胞炎性反应及肝细胞坏死[9]。IL-1可活化多种蛋白激酶,参与肝组织纤维化过程[10]。IL-6是单核及巨噬细胞等对TNF-α、IL-1反应的产物,促进肝脏炎性损伤及纤维化。另一方面,IL-6又能反向促进巨噬细胞释放TNF-α等,加重炎症反应[10]。IL-6在炎症环境中含量丰富,也是最典型的原致瘤细胞因子之一,可影响细胞增殖、存活、分化、迁移、侵袭、转移、血管生成、炎症和代谢。临床研究也证实IL-6信号通路的阻断是治疗炎症性疾病的有效方法。IL-10是一种多功能负性调节因子,具有抗炎及抗纤维化作用[12,13]。IL-10可控制免疫细胞激活,抑制促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6,改善脂质过氧化和胰岛素抵抗,减少胶原生成,介入肝脏纤维化重塑。

赵文霞教授认为“痰湿内停、瘀血阻络、肝失条达”是 NASH 发病的主要病机,因此确立了“化痰祛湿活血”的基本治则,制定化痰祛湿活血方。方中泽泻利水渗湿,丹参活血化瘀,共为君药;郁金行气活血,海藻软坚消痰,山楂消食化瘀,共为臣药;决明子清肝利湿,水飞蓟清热舒肝,共为佐药;柴胡疏肝解郁、引药归经为使药。全方共奏化痰祛湿活血之功。前期研究证实,该方能有效改善NASH患者肝脏炎症[14,15],可下调NASH大鼠炎性因子TNF-α等的表达,减轻肝脏炎症,改善肝组织脂肪变程度,抗肝纤维化[16~20]。本实验通过复制L02脂肪变细胞模型,采用ADPN及化痰祛湿活血含药血清进行干预,结果显示,模型组细胞炎性反应及脂肪变程度均高于空白组,细胞及培养上清液中TNF-α、IL-1、IL-6的表达也明显增加,IL-10的表达则显著减少,这提示L02脂肪变细胞的炎性反应与上述炎性因子的表达相关。ADPN及化痰祛湿活血方含药血清干预后,细胞及培养上清液中TNF-α、IL-1、IL-6的表达也明显降低,IL-10的表达则明显升高,提示化痰祛湿活血方可通过调控炎症因子表达起到改善脂肪变细胞炎症的作用。

综上所述,本研究从细胞因子层面探讨化痰祛湿活血方治疗NASH的作用机制,发现化痰祛湿活血方可能通过下调IL-1、IL-6、TNF-α以及上调IL-10表达,使脂肪变L02细胞炎性反应程度降低,从而起到防治NASH的作用,在此过程中有哪些信号通路参与尚需进一步研究。

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