蜂毒溶血肽改善非酒精性脂肪肝大鼠肝组织脂肪沉积作用及其机制研究*

王 艳，苏 峰，李园园，李 舒

作者单位:274300山东省单县 济宁医学院附属湖西医院消化内科（王艳，苏峰，李园园）；锦州医科大学附属第一医院消化内科（李舒）

随着现代药理学的发展，发现蜂毒溶血肽具有抗氧化和抗炎等作用[1-5]。我们观察了蜂毒溶血肽对NAFLD模型大鼠血糖、血脂和肝功能的影响，以期为NAFLD的临床治疗提供理论依据，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器、药品和试剂 雄性SPF级SD大鼠，体质量200～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司【动物许可证号:SCXK（湘）2011-0003】。酶标仪、电泳系统均购自美国Bio-Rad公司，电子天平购自上海奔普仪器科技有限公司，全自动生化分析仪购自日本日立公司，紫外分光光度计购自上海光学仪器五厂有限公司。蜂毒溶血肽购自上海熹垣生物科技有限公司。普通饲料、高脂饲料和血清检测试剂盒、抗核转录因子E2相关因子 2（Nrf2）、抗血红素加氧酶-1（HO-1）和抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）均购自瑞士Roche公司。

1.2 NAFLD大鼠模型的构建 取40只大鼠，适应性饲养1 w。随机将大鼠分为对照组、模型组、小剂量蜂毒溶血肽处理组和大剂量蜂毒溶血肽处理组。在对照组，给予普通饲料喂养，给予其他三组大鼠高脂饲料喂养，构建NAFLD大鼠模型。在高脂饲料喂养4 w后，分别给予蜂毒溶血肽10 μg·kg-1·d-1和100μg·kg-1·d-1皮下注射，在对照组和模型组，则给予同等量的生理盐水皮下注射。连续给药12 w后，常规行肝组织学检查。

1.3 血清学检测 使用全自动生化分析仪检测血生化指标；采用ELISA法检测血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平。

1.4 大鼠肝脏组织Nrf2和HO-1蛋白表达检测 采用Western blot法检测，简要步骤如下:取大鼠肝脏组织，剪碎，加入裂解液裂解，沸水浴下使蛋白变性，采用BCA法检测蛋白定量，行SDS凝胶电泳，以β-actin作为内参照，实验结束时，应用Image J图像处理软件计算各条带吸光度值。

1.5 统计学处理 应用SPSS 19.0软件包处理数据。计量资料均服从正态分布，以（±s）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验。当P＜0.05时，表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织学表现情况 模型组大鼠肝细胞大小不一，胞内存在大小不等的脂肪颗粒沉积，小叶内炎性细胞浸润；小剂量蜂毒溶血肽处理组大鼠肝内脂肪颗粒堆积和炎性细胞浸润减轻，而大剂量蜂毒溶血肽处理组大鼠肝细胞排列整齐，未见脂肪颗粒堆积和炎性细胞浸润（图1）。

2.2 各组大鼠体质量和肝质量水平比较 与模型组比，小剂量和大剂量蜂毒溶血肽处理组大鼠体质量和肝质量均有不同程度的下降（P＜0.05），而大剂量蜂毒溶血肽处理组动物体质量和肝质量下降更为明显（表 1）。

2.2 各组大鼠血清AST和ALT水平比较 与模型组比，小剂量和大剂量蜂毒溶血肽处理组大鼠血清AST和ALT水平均有不同程度的下降（P＜0.05），大剂量蜂毒溶血肽处理组血清AST和ALT水平下降更为明显（表2）。

2.3 各组大鼠血糖和血脂水平比较 与模型组比，小剂量和大剂量蜂毒溶血肽处理组大鼠血糖、TC、TG和LDL-C水平均有不同程度的下降（P＜0.05），大剂量蜂毒溶血肽处理组血糖、TC、TG和LDL-C水平下降更为明显（表3）。

2.4 各组大鼠血清氧化应激指标比较 与模型组比，小剂量和大剂量蜂毒溶血肽处理组大鼠血清SOD和GSH水平均有不同程度的升高（P＜0.05），MDA水平有不同程度的降低（P＜0.05），大剂量蜂毒溶血肽处理组血清SOD和GSH水平升高，而MDA水平下降更为明显（表4）。

2.5 各组大鼠肝组织Nrf2和HO-1蛋白表达情况的比较 与模型组比，小剂量和大剂量蜂毒溶血肽处理组大鼠肝组织Nrf2和HO-1蛋白表达均有不同程度的增强（P＜0.05），大剂量蜂毒溶血肽处理组肝组织Nrf2和HO-1蛋白表达增强更为明显（图2，表5）。

图1 四组大鼠肝组织学表现 （HE，400×）

表1 四组大鼠体质量和肝质量（±s）比较

表1 四组大鼠体质量和肝质量（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

只数 体质量（g） 肝质量（g）对照组 10 368.0±23.6 8.8±0.7模型组 10 435.2±22.1 14.3±1.4小剂量蜂毒溶血肽 10 398.7±19.5 12.2±1.4大剂量蜂毒溶血肽 10 380.2±20.8 10.4±1.3

表2 四组大鼠血清AST和ALT水平（±s）比较

表2 四组大鼠血清AST和ALT水平（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

例数 AST（U/L） ALT（U/L）对照组 10 29.2±5.4 42.3±5.5模型组 10 159.7±18.9 77.7±6.8小剂量蜂毒溶血肽 10 122.6±14.5 69.4±7.0大剂量蜂毒溶血肽 10 88.0±10.4 49.3±6.2

表3 四组大鼠血糖和血脂水平（±s）比较

表3 四组大鼠血糖和血脂水平（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

例数 血糖（mmol/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L） LDL-C（mmol/L）对照组 10 4.8±0.6 1.1±0.1 0.6±0.1 0.1±0.1模型组 10 18.3±2.4① 2.8±0.3① 1.5±0.2① 0.5±0.1①小剂量蜂毒溶血肽 10 15.4±2.0①② 2.4±0.3①② 1.2±0.1①② 0.4±0.1①②大剂量蜂毒溶血肽 10 8.7±1.8①② 1.6±0.2①② 0.8±0.1①② 0.3±0.1①②

表4 四组大鼠血清氧化应激指标（±s）比较

表4 四组大鼠血清氧化应激指标（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

例数 SOD（U/L）对照组 10 95.2±8.7模型组 10 30.4±5.3①小剂量蜂毒溶血肽 10 46.7±4.9①②大剂量蜂毒溶血肽 10 82.1±6.6①②MDA（nmol/mL）4.2±0.5 13.1±1.6①10.8±1.4①②6.3±0.8①②GSH（mmol/L）9.2±1.4 2.3±0.5①4.1±0.5①②8.7±0.9①②

图2 四组大鼠肝组织Nrf2和HO-1蛋白表达情况

表5 四组大鼠肝组织Nrf2和HO-1蛋白表达（±s）比较

表5 四组大鼠肝组织Nrf2和HO-1蛋白表达（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

例数 Nrf2 HO-1对照组 10 1.5±0.2 1.3±0.1模型组 10 0.3±0.1① 0.3±0.1①小剂量蜂毒溶血肽 10 0.7±0.1①② 0.8±0.1①②大剂量蜂毒溶血肽 10 1.4±0.2② 1.2±0.1②

3 讨论

本实验采用高脂饲料喂养造模，通过检测大鼠体质量、肝质量、血糖、血脂和肝功能指标，观察大鼠肝组织细胞形态变化，确定NAFLD大鼠是否造模成功，验结果表明，通过喂养高脂饲料，模型组大鼠体质量、肝质量、血糖、血清 TC、TG、LDL-C、AST和ALT水平均较对照组升高，且通过肝组织观察到模型组大鼠肝组织肝细胞大小不一，细胞内有大小不等的脂肪颗粒沉积，组织内炎性细胞浸润，表明NAFLD大鼠造模成功。

目前，临床主要采取控制饮食、增加运动量和服用药物等对NAFLD患者进行干预[6-10]。其中，治疗药物主要为降脂药物和护肝药物等，其效果只能暂时调节NAFLD患者血糖、血脂和肝功能指标，治疗过程较长[11-13]。因此，寻找针对NAFLD治疗的特效药物势在必行。蜂毒溶血肽是由蜜蜂毒腺分泌的一种多肽类物质，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种生物学作用[14，15]。在NAFLD大鼠皮下注射蜂毒溶血肽干预12周，发现大鼠体质量和肝质量均较模型组大鼠降低，血糖、血清 TC、TG、LDL-C、AST 和 ALT 水平也降低，表明蜂毒溶血肽对NAFLD大鼠有治疗作用，且随着蜂毒溶血肽给药剂量的增加，效果也越明显。

据文献报道，氧化应激反应能促进NAFLD的发生和发展[16]。当肝脏抗氧化作用超出正常能力时，肝脏就会发生氧化应激反应，导致大量的过氧化物生成，损伤肝脏细胞[17，18]。Nrf2/HO-1通路主要调控机体抗氧化能力[19]。促进Nrf2/HO-1通路激活，可有效提高机体抗氧化能力，避免氧化应激带来的损伤[20]。本研究对蜂毒溶血肽干预NAFLD大鼠的作用机制进行了初探，实验结果表明，与模型组比，小剂量蜂毒溶血肽处理组和大剂量蜂毒溶血肽处理组大鼠血清SOD、GSH水平均有不同程度的升高，而MDA水平降低。大剂量蜂毒溶血肽处理组血清SOD和GSH水平升高，MDA水平下降更为明显。与模型组比，小剂量蜂毒溶血肽处理组和大剂量蜂毒溶血肽处理组大鼠肝组织Nrf2和HO-1蛋白表达明显增强，而以大剂量蜂毒溶血肽处理组更为明显。以上结果表明蜂毒溶血肽可促进Nrf2/HO-1通路激活，提升动物血清SOD和GSH水平，降低MDA水平，进而保护肝脏，减轻脂肪变程度。

综上所述，蜂毒溶血肽对NAFLD大鼠肝脏有保护作用，可能是通过调控Nrf2/HO-1通路，促进了大鼠的抗氧化能力。由于肝脂肪变的发生机制较为复杂，可能涉及多个通路的激活和细胞因子的参与。