金雀异黄酮对创伤后应激障碍大鼠焦虑恐惧样行为的干预作用*

陈瑞麒，曹方正，林慧敏，朱晨仪，邹宛芸，于子雯，周 欢，孟泽宇，范 勇，邱新宇，吴仲敏

（台州学院 医学院，浙江 台州 318000）

创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder，PTSD）是由于个体在生命的某个时刻遭受到突发的威胁事件或意外的严重创伤而引发的长期持续精神障碍［1］。患者常表现出严重的焦虑、恐惧以及对创伤相关环境的逃避，症状迁延时久甚至终身难愈，严重影响了患者的生活质量。然而，至今在临床上仍缺乏有效的防治药物。金雀异黄酮（Genistein，GEN）是一种来源于大豆的天然异黄酮，具有抗氧化、免疫和抗炎活性，可调节多种细胞功能［2］，但其是否有防治PTSD作用，鲜有文献报道。本研究采用连续单一应激（SPS）和足底电击（S）相结合方法制备 PTSD 大鼠模型［3］，并利用旷场实验（open field test，OFT）、高架十字迷宫（elevated plus maze，EPM）实验和僵立行为实验来评价GEN对PTSD大鼠焦虑恐惧样行为的干预作用，以期为PTSD的预防和治疗提供新的用药选择。

1 材料和方法

1.1 实验仪器、药物及试剂

EPM实验仪器（型号：JLBehv-OFT-4，上海吉量软件科技有限公司）；OFT实验仪器（型号：JLBehv-EPMG，上海吉量软件科技有限公司）；Super Maze动物行为学视频分析系统（上海吉量软件科技有限公司）；GEN（货号：FS-（BR）-0317，纯度＞98%，上海抚生实业公司）。

1.2 实验动物及分组

健康成年雄性SD大鼠，SPF级，体重200±20 g，购自温州医科大学实验动物中心，大鼠经一周适应性饲养，通过旷场箱开场实验，弃去水平运动加上垂直活动总分低于10分者。将旷场箱开场实验合格的大鼠54只随机分成三组，即：对照组、模型组、GEN干预组，每组18只。

1.3 实验方法

1.3.1 PTSD模型制备及干预方法

所有大鼠经过一周的适应性饲养后，除外对照组，余下的36只大鼠均采用SPS+S方法制备PTSD模型，大鼠首先给予SPS刺激，即：禁锢2 h、强迫游泳20 min、乙醚麻醉至昏迷，30 min后将苏醒的大鼠放置在电击箱内（电击箱采用特制塑料制作，大小为40 cm×30 cm×25 cm），适应196 s后给予足底电击，电击连续15个循环周期（电流0.8 mA，持续10 s，间歇10 s）。对照组大鼠放入同样的电击箱内，停留10 min，但不给以足底电击刺激。足底电击刺激完成后所有大鼠均放回原鼠笼内饲养。饲养环境要求为：室温22℃-25℃、昼夜节律、自由饮水摄食。每天上午9∶00予GEN干预组大鼠腹腔注射GEN 8 mg·kg-1，GEN首先在二甲基亚砜（DMSO）中以0.1 kg/L的浓度溶解，然后用生理盐水稀释至使用浓度。对照组和PTSD模型组大鼠则每日上午给予腹腔注射等浓度的二甲基亚砜生理盐水。各组腹腔注射体积均为5 ml·kg-1，分别在连续给药的第1，7，14天时随机抽取各组大鼠6只进行行为学测试。

1.3.2 EPM实验

在连续给药的第1，7，14天时分别随机抽取各组大鼠6只进行旷场实验，实验安排在安静的旷场室内进行，所采用的旷场箱大小为100 cm×100 cm×40 cm，箱体呈立方形，内侧壁及底面涂以灰色，用黑线将底面划分成25个小正方格，每个正方格的大小均为20 cm×20 cm。沿周边的16个正方格为外周格，位于中央的9个正方格称中央格。在正中央方格上方安置高像素摄像头。旷场实验开始时将大鼠放入箱内正中央方格中，采用Super Maze动物行为学视频分析进行摄像记录，连续观察5 min内大鼠在旷场箱内的运动总路程、在中央格区域停留时间和在中央格区域活动次数。每只大鼠测试1次，每次测试后，立即使用75%酒精清洁箱内壁及底面，再接着做下一只测试。

1.3.3 OFT实验

EPM实验结束后各组大鼠分别进行OFT实验，将待测试的大鼠放置在高架十字迷宫开臂与闭臂交汇处的正中央区域，大鼠头部朝向开臂方向，采用Super Maze动物行为学视频分析系统记录5 min内大鼠进入开臂次数和滞留开臂时间。观察各组大鼠进入开臂次数百分比和滞留开臂时间百分比。

1.3.4 僵立行为实验

OFT实验结束后将实验大鼠放回原造模电击箱内，观察4 min内大鼠出现僵立行为总次数，每10 s记录一次，表现出僵立行为时记作阳性，以木僵率表示大鼠僵立阳性总次数占总次数的百分比。

1.3.5 实验中需要记录的评价指标

1.3.5.1 OFT实验测试中，当大鼠出现焦虑心理时，大鼠在开阔和新异环境中会表现出恐惧和探究之间的矛盾心理，在OFT实验时，焦虑越严重的大鼠越倾向于在外周格内活动，以求得安全感。反之，焦虑情绪越低的大鼠，其进入中央格的次数会越多，在中央格区域活动的时间也越长。实验评价指标有：运动总路程、停留中心格区域时间和进入中心格区域次数。

1.3.5.2 EMP实验主要检测大鼠对新异环境的探究能力以及对高悬开臂环境的恐惧情绪。焦虑程度越低的大鼠进入开臂时间和次数就越多，反之则说明其焦虑程度越高。评价指标包括：开臂时间百分比（%）、开臂次数百分比（%）。

1.3.5.3 僵立行为是大鼠表达恐惧情绪的外在行为方式，是一种典型的动物自我防御反应，出现僵立行为的大鼠通常表现为刻板式蹲伏姿势，外观仅见有节律的呼吸运动，其余的运动均消失。通过计算木僵率来评价。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用r检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 GEN干预后PTSD大鼠OFT得分增加

见表1，图1-3所示，在OFT测试中，实验第1天各组大鼠各项观察指标值差异无统计学意义（P＞0.05），实验第7、14天时，PTSD模型组大鼠在运动总路程、进入中央区域时间和次数均明显减少，GEN干预组大鼠在运动总路程、进入中央区域时间和次数均有明显增加。统计学分析发现GEN干预7天组和14天组与同时间段对照组和PTSD组相比大鼠在运动总路程（F=30.878，P=0.001；F=137.322，P=0.000），进入中心区域时间（F=32.495，P=0.001；F=137.322，P=0.000）和进入中心区域次数（F=20.600，P=0.002；F=41.198，P=0.000）上差异具有统计学意义，进一步作二二比较发现GEN干预组与PTSD模型组之间上述指标的差异有显著统计学意义（所有P值均＜0.01），而GEN干预组与对照组之间上述指标的差异无统计学意义（P＞0.05）。以上结果说明SPS+S应激刺激有效引发了大鼠的焦虑恐惧样行为，而GEN干预可以有效改善大鼠应激所致的焦虑恐惧状态。

表1 大鼠旷场实验结果比较（n=6，x±s）

图1 大鼠旷场箱内运动总路程比较（n=6，x±s）

图2 大鼠旷场箱内进入中央区域次数比较（n=6，x±s）

图3 大鼠旷场箱内中央区域停留时间比较（n=6，x±s）

2.2GEN干预后PTSD大鼠EMP得分增加

如表2，图4-5。实验第1天各组大鼠在EMP中进入开臂次数和在开臂区活动时间百分比差异均无统计学意义（P＞0.05），GEN干预7天组和14天组与同时间段对照组和PTSD组比较大鼠在进入开臂次数（F=38.140，P=0.000；F=56.980，P=0.000）和开臂滞留时间百分比（F=116.704，P=0.000；F=139.764，P=0.000）上差异具有显著统计学意义，GEN干预组大鼠进入开臂次数和开臂滞留时间百分比显著高于PTSD模型组（P＜0.01），PTSD模型组大鼠在EPM中进入开臂次数和开臂滞留时间百分比均显著低于对照组（P＜0.01），而GEN干预组与对照组比较上述指标值差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 大鼠高架十字迷宫测试结果比较（n=6，x±s）

图4 大鼠高架十字迷宫内进入开臂次数比较（n=6，x±s，%）

图5 大鼠高架十字迷宫内开臂滞留时间比较（n=6，x±s，%）

2.3 GEN干预后PTSD大鼠木僵率降低

见表3，图6所示。实验第1天各组大鼠木僵率差异无统计学意义（P＞0.05），GEN干预7天组和14天组与同时间段对照组和PTSD组比较大鼠木僵率（F=18.283，P=0.003；F=61.212，P=0.000）差异具有统计学意义，经二二比较发现GEN干预组大鼠木僵率显著低于PTSD模型组（P＜0.01），PTSD模型组大鼠木僵率显著高于对照组（P＜0.01），而GEN干预组大鼠木僵率略高于对照组，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 大鼠旷场箱内僵立行为测定结果比较（n=6，x±s，%）

图6 大鼠旷场箱内僵立行为测定结果比较（n=6，x±s，%）

3 讨论

PTSD是一种慢性精神疾病，患者常表现出严重的焦虑、恐惧以及对创伤相关环境的逃避。由于其发病的详尽机制至今不清，长期以来缺乏有效的防治药物。近年来，一些植物提取物在抗焦虑恐惧方面的作用引起了人们的广泛关注，有研究报道，银杏内酯B对高原缺氧大鼠焦虑样行为有明显减缓作用［4］。本研究采用SPS+S方法制备PTSD大鼠模型，并选用金雀异黄酮，一种天然植物中提取的异黄酮单体成分进行干预治疗，评价其对PTSD大鼠焦虑恐惧样行为的干预效果。

本研究采用OFT、EPM和僵立行为等经典的动物行为学实验方法来评价PTSD大鼠在焦虑恐惧样行为方面的变化以及GEN的干预作用。OFT实验中大鼠在旷场箱内运动总路程反应了大鼠的兴奋性和灵活性，我们发现GEN干预组大鼠在实验的第7、14天时运动总路程明显高于PTSD模型组，组间比较差异具有统计学意义（表1，图1），表明GEN可以改善SPS+S所致的大鼠兴奋性下降。同时，GEN干预组大鼠在进入中心区域的时间和次数上均显著多于PTSD模型组（P＜0.01），说明GEN干预可以有效改善大鼠的焦虑恐惧状态。在EPM实验中，PTSD模型组大鼠在实验的第7、14天时进入开臂的时间和次数显著低于正常对照组（P＜0.01），而GEN干预组上述指标值明显高于PTSD模型组（P＜0.01），说明GEN干预下大鼠的焦虑恐惧情绪有了一定程度的缓解。进一步的僵立行为测试发现，GEN组大鼠的木僵率较之模型组有显著降低（P＜0.01），表明GEN可以有效减缓PTSD大鼠的恐惧表达。本实验发现，在实验第1天时各组大鼠各项行为学指标值差异均无统计学意义，而在实验第7、14天时上述指标值差异均有显著意义，表明SPS+S刺激、GEN干预与大鼠行为学改变之间均存在一定的时效关系，通过上述行为学实验，初步说明长时程的GEN干预对SPS+S导致的大鼠焦虑恐惧样行为有明显的改善作用。

GEN与雌激素具有相似的结构，是典型的植物雌激素［5］，在临床上作为激素治疗的一种替代方法，有效地缓解绝经后妇女的抑郁症状［6］，此外，在去卵巢雌性大鼠中也观察到GEN的抗抑郁作用［7］，本实验发现GEN干预后PTSD大鼠在OFT新异环境中的过度焦虑以及高架十字迷宫空旷条件下的条件性恐惧行为均有不同程度的减缓，大鼠的运动距离和探索时间也有明显增加（表1、2）。这些结果表明，GEN在缓解PTSD大鼠的焦虑恐惧行为方面是有效的。本实验的研究对象为成年雄性大鼠，因此很难以雌激素替代品来解释GEN的抗焦虑恐惧机制。有研究报道，PTSD大鼠杏仁核脑区5-羟色胺含量明显降低，而GEN通过上调应激大鼠杏仁核神经元色氨酸羟化酶活性，增加5-羟色胺的生物合成，并通过不同的5-羟色胺受体和相关的信号传导途径来调节情绪相关行为［8，9］。也有报道认为GEN的潜在作用靶点包括 GABA［10］、甘氨酸［11］，5-羟色胺［12］，Ca2+通道［13］等。我们认为，GEN 可能还参与调控除杏仁核外的其他脑区如海马、前额皮质、丘脑、下丘脑和扣带回等的神经递质水平和对应受体的活性，并通过相关的信号通路来调节中枢神经系统的情绪调节功能。本研究发现了GEN对PTSD大鼠焦虑恐惧样行为的明显调节作用，但其确切的作用机制尚不清楚，值得深入研究。