慢病毒介导的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体过表达对食管癌细胞生长的影响

李 泮，袁 方，李二威，李付广

(1.郑州大学基础医学院,河南 郑州 450001；2.阜外华中心血管病医院输血科，河南 郑州 450018)

食管癌是发生于食管上皮组织的恶性肿瘤，其早中期时有治愈可能，晚期治愈难度较大，目前主要治疗方法包括手术、化疗、放疗以及靶向治疗等。近年来随着靶向治疗等生物治疗手段的丰富和诊疗技术的提高，食管癌患者的治疗效果和生存率有了一定提高。

近年来，慢病毒载体已被广泛应用于多种肿瘤的研究，其可以将外源基因有效整合到宿主染色体上，具有持久稳定表达等特点[1]。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand，TRAIL)是肿瘤坏死因双家族的一员，通过与细胞膜表面受体特异性结合可以调控肿瘤细胞增殖和凋亡[2]。目前关于慢病毒介导的TRAIL过表达在食管癌中的作用的研究还未见报道。因此，本研究构建重组慢病毒plenti-TRAIL来探讨TRAIL过表达对食管癌细胞生长的作用，为进一步研究TRAIL在食管癌中的作用机制提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养食管癌Eca-109细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库。将Eca-109细胞接种于含有体积分数10%胎牛血清及青霉素100 u·mL-1和链霉素100 g·mL-1的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中进行常规培养。

1.2 TRAIL片段制备按照天根核糖核酸(RNA)simple总RNA提取试剂盒流程对293T细胞进行总RNA提取，对总RNA进行反转录得到互补脱氧核糖核酸(cDNA)，利用该cDNA为模板对TRAIL进行聚合酶链反应(PCR)扩增，并对TRAIL片段进行EcoR I和Not I酶切。

1.3 构建重组慢病毒首先胶回收均经过EcoR I和Not I酶切后的TRAIL片段和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP线性载体，对2个片段进行连接转化，挑取单克隆菌落进行鉴定后，提取质粒，获得plenti-TRAIL重组慢病毒表达载体。

1.4 重组慢病毒包装和滴定将293T细胞以3×106个细胞/皿传至10 cm平皿。次日待长至90%贴壁率时，准备转染试剂，共转染18 h后，适量磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，并更换为10 mL完全DMEM培养基。共转染72 h后，收集病毒培养基，15 mL无菌离心管中3 000 r·min-1离心5 min，0.45 μm滤器过滤，再25 000 r·min-1、4 ℃超速离心90 min后，弃上清。无菌操作，加入病毒原液体积1%的DMEM培养基，每隔15 min轻轻吹打1次，使慢病毒颗粒重悬，使病毒颗粒彻底悬浮。分装后，-80 ℃冻存备用，然后进行滴度测定。将重组慢病毒命名为LV-TRAIL。

1.5 慢病毒感染效率测定将Eca-109细胞以1×105/孔的细胞密度接种于24孔板中，设3个复孔，用正常培养基梯度稀释病毒液105～108IU·mL-1，并梯度感染细胞。每孔加入8 μg·mL-1的多聚季铵。37 ℃感染2 h，期间每20 min晃动平板，使病毒充分感染细胞。1 000 r·min-1，10 min，水平离心平板，轻轻弃去培养基，添加含体积分数2%血清新鲜培养基，继续培养。4 d后观察荧光表达情况，计算感染效率。

1.6 MTT实验检测TRAIL过表达对Eca-109细胞增殖的影响细胞在6孔板中转染48 h后，接种在96孔板中，细胞数为1×105个/mL，每孔加入100 μL细胞悬液，培养过夜后进行转染，每组设3个平行孔，37 ℃，分别培养24、48、72 h，加入5 mg·mL-1MTT 20 μL，继续培养4 h，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，混匀，酶标仪(波长=570 nm)测定吸光度(A570)。

1.7 流式细胞仪检测TRAIL过表达对Eca-109细胞凋亡的影响将细胞接种在6孔板中，细胞数为5×105个/mL，培养过夜后进行转染，每组设3个平行孔，培养48 h后，胰酶消化，收集细胞，1 500 r·min-1离心5 min，PBS(0.01 mol·L-1，pH 7.4)洗1次，按照流式凋亡检测试剂盒说明书进行操作，加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V/PE和10 μL 7-ADD，轻轻混匀，避光室温孵育反应10 min。加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀，样品在1 h内用流式细胞仪和荧光显微镜检测。

1.8 Transwell检测TRAIL过表达对Eca-109细胞侵袭的影响首先将冻存于-80 ℃的Matrigel放于4 ℃条件下过夜，变成液态；取300 μL无血清培养基，加入60 μL Matrigel，混匀，在上室加入100 μL混合液，常规培养4～5 h；之后消化细胞，用无血清培养基洗3次，并配成细胞悬液；用无血清培养基洗Matrigel 1次，每孔中加入100 μL细胞悬液；下室中加入500 μL含有体积分数20%胎牛血清培养基；37 ℃培养箱中，孵育20～24 h；取出Transwell用PBS洗2次，用质量分数5%戊二醛固定，放于4 ℃；加入质量分数0.5%结晶紫染色，室温下放置30 min后，用PBS洗2次，擦去上表面细胞，放于显微镜下观察。

2 结果

2.1 重组慢病毒滴度测定将目的慢病毒载体质粒与包装质粒共转染293T细胞后，收集病毒，然后经浓缩后进行病毒滴度测定，经测定LV-TRAIL病毒滴定值为2×108TU·mL-1。

2.2 重组慢病度感染效率测定用LV-TRAIL慢病毒感染Eca-109细胞，观察细胞中荧光表达结果，发现大部分细胞有绿色荧光表现，计算所得感染效率为90%。

2.3 TRAIL过表达对Eca-109细胞增殖的影响利用MTT法检测TRAIL过表达对Eca-109细胞增殖的影响，对照组细胞24 h、48 h、72 h的光密度(OD)值分别为0.632±0.057、0.949±0.071、1.679±0.162，TRAIL过表达组细胞24 h、48 h、72 h的OD值分别为0.476±0.049、0.716±0.034、0.952±0.091，说明TRAIL过表达明显抑制Eca-109细胞的增殖。见图1。

图1 MTT检测各组Eca-109细胞的增殖情况

2.4 TRAIL过表达对Eca-109细胞凋亡的影响利用流式细胞仪检测TRAIL过表达对Eca-109细胞凋亡的影响，对照组和TRAIL过表达组细胞凋亡率分别为4.5%和13.8%，表明TRAIL过表达明显促进Eca-109细胞的凋亡。见图2。

图2 流式细胞仪检测各组Eca-109细胞的凋亡情况

2.5 TRAIL过表达对Eca-109细胞侵袭的影响利用Transwell实验检测TRAIL过表达对Eca-109细胞侵袭的影响，对照组细胞侵袭数为15.0±1.5，TRAIL过表达组细胞侵袭数为51.0±5.2，说明TRAIL过表达明显抑制Eca-109细胞的侵袭。见图3。

图3 Transwell实验检测各组Eca-109细胞的侵袭情况

3 讨论

TRAIL能特异性杀伤培养和异种移植肿瘤中的多种肿瘤细胞，但对正常细胞的杀伤作用很小，甚至没有影响，因此其是肿瘤治疗的理想靶标分子。TRAIL是一种有效的凋亡诱导细胞因子[3-4]。TRAIL不仅对结肠癌[5]、肺癌[6]、肾癌[7]、肝癌[8]等多种实体瘤细胞具有促凋亡作用，而且也可以诱导包括白血病在内的血液系统肿瘤细胞的凋亡[9]。TRAIL诱导的细胞凋亡与TRAIL和膜受体TRAIL-r1、TRAIL-r2相互作用有关。这种相互作用导致受体分子FAS-相关蛋白与死亡域结合，导致启动子caspase-8的积累，进而激活效应因子caspase，如caspase-3，从而引起细胞凋亡[10]。有研究[11-12]发现，TRAIL在食管癌中表达下调能够诱导细胞凋亡。本研究也有类似的发现，TRAIL过表达能够明显促进Eca-109细胞的凋亡。

除了促进凋亡外，本研究还发现TRAIL过表达能够明显抑制Eca-109细胞的增殖和侵袭。经查阅文献，有很多关于TRAIL可以抑制肿瘤细胞增殖和侵袭的研究。杨阳等[13]研究发现，TRAIL联合化疗或热疗可以抑制人肝癌SMMC-7721细胞的体外增殖；王才智等[14]研究发现TRAIL联合低浓度化疗药物多西他赛、顺铂等可以显著抑制子宫内膜癌细胞增殖，诱导细胞凋亡；李秀萍等[15]研究发现TRAIL通过降低表皮生长因子受体的表达水平抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭。除了影响增殖、侵袭和凋亡外，TRAIL还可以增强食管癌的化疗疗效，提高药物敏感性，例如顺铂等化疗药物[16]。因此，TRAIL有成为食管癌重要治疗手段的潜力，有必要进一步开展关于TRAIL在食管癌治疗中的相关研究。

综上所述，本研究发现TRAIL过表达能够明显抑制食管癌细胞的增殖和侵袭，促进细胞凋亡，进而发挥抑制肿瘤发展的作用，有成为食管癌治疗靶点的潜力。然而，TRAIL过表达对食管癌细胞迁移、周期以及上皮间质转化等的影响以及分子机制还不清楚，有待进一步研究。这些研究对于提高食管癌患者的生存率和生活质量具有重要的意义。